세포 용해를위한 소니케이션(초음파 처리 분해) 프로토콜

세포 용해를위한 소니케이션(초음파 처리 분해) 프로토콜

소개

소니케이션 (초음파 처리 분해) 는 샘플 내 입자를 교반하기 위해 음향 에너지를 적용합니다. 사용되는 초음파 주파수는 일반적으로 20kHz보다 큽니다. 실험적인 환경에서는 일반적으로 초음파 수조 또는 초음파 프로브를 사용하여 수행됩니다.

실험실에서 초음파 검사는 주로 세포 파괴의 방법으로 사용됩니다. 소니케이션(초음파 처리 분해)은 세포막을 파괴하고 세포 내용물을 방출하는 데 사용되며, 이 과정은 일반적으로 소노포배급이라고합니다. 소니케이션(초음파 처리 분해)은 세포를 분리하기 위해 단백질 추출물을 준비하는 동안 수행됩니다. 용해 버퍼를사용할 수 있지만 초음파 분리 세포를 깰 수 있습니다. 또한 소니케이션(초음파 처리 분해)은 DNA를 단편/전단하는 데 사용할 수 있어 추가 샘플 준비를 방해할 수 있습니다. 다른 생물학적 용도로는 나노 입자, 리포솜, 안토시아닌 및 항산화 제 추출이 포함됩니다.

세포 유형 (박테리아 또는 진핵) 에 따라 특정 세포 유형을 분해하기가 어려울 수 있으며 세제 완충제 단독으로 배치하면 전체 세포 용해를 초래하지 않습니다. 또한 세포 소기관을 용해시키고 세포벽을 용해시키지 않고 세포질을 방출해야 할 수도 있습니다. 티타늄 프로브를 사용하여 세포의 초음파 분석은 세포를 완전히 용해시키고 모든 DNA, RNA 및 세포의 단백질 함량을 추출하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이것은 ELISA 분석 및 면역 항진을위한 더 균질 한 추출물을 찾을 때 하류에 도움이 될 수 있습니다.

소니케이션(초음파 처리 분해)

세포 용해를 위해 아래의 초음파 프로토콜을 따르는 경우 필요한 용도에 맞는 효율적인 세포 용해를 달성해야 합니다.

  1. 미세 원심 분리기에서 270xg에서 5분 동안 원심 분리기 셀.
  2. 나머지 매체를 흡인하고 30 — 100 μL의 RIPA 버퍼로 세포를 재흡수합니다.
  3. 펠렛을 얼음에 30 분 동안 부양시킵니다.
  4. 다음과 같이 샘플을 소니케이트(초음파 처리 분해)합니다.
  5. 소니케이터(초음파 처리 분해) 프로브를 20kHz의 주파수에 놓습니다.
  6. 1.5 mL의 미세 원심 분리기 튜브에 셀을 넣고 소니레이터 (초음파 처리 분해)프로브의 끝 아래로 부드럽게 움직입니다.
  7. 프로브는 점도를 줄이기 위해 2 X 10 초 동안 버퍼를 진동시키기 시작합니다 (이는 샘플의 발포를 초래할 수 있음).
  8. 이 프로토콜에서 그러나 샘플의 거품은 우리가 면역 항진, 웨스턴 블로 팅 또는 ELISA 분석에 수행 할 때 초음파 검사 다음 문제로 표시되지 않았습니다.
  9. 샘플의 점도에 따라 셀을 다시 10초 동안 초음파 처리 할 수 있습니다.
  10. 일단 샘플은 5 분 동안 얼음에 배양됩니다.
  11. 10,000xg에서 20분간 원심 분리기 (파편에는 용해되지 않은 세포, 핵 또는 용해되지 않은 소기관이 포함될 수 있음).
  12. 상위자를 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브 및 라벨로 옮깁니다.
  13. -20 °C에서 보관하십시오.

세균 세포 및 소화의 사르코이슬 용해

  1. BL21 세포의 사르코실 용해 및 Caferone 단백질 BL21 세균 펠렛의 제거는 얼음 차가운 나트륨 트리 - EDTA (STE) 버퍼 (10 mm 트리 - HCL, pH 8.0, 1 mm EDTA, 150 MM NaCl 100mm PMSF 보충) 의 50 ml에 소생되었습니다.
  2. 리소자임 500L (10 mg/ml) 을 넣고 얼음에 15 분 동안 배양하십시오.
  3. DTT 500ul과 사르코실 7ml를 더한다 (STE 버퍼로 만든 10% (w/v)).
  4. 모든 정화 버퍼는 얼음을 차갑게 유지하고 샘플은 얼음 위에 보관해야 합니다. 모든 정화 단계는 가능한 경우 차가운 방에서 수행되었습니다.
  5. 각 소음화 사이에 2분 간격으로 3 x 30초 동안 소니케이트 (초음파 처리 분해)샘플.
  6. 추가 정제 단계를 위해 얼음에 시료를 놓거나 -80°C에서 보관하십시오.

힌트 및 팁

  1. 항상 얼음에 샘플을 보관하십시오. 샘플이 분열되는 소니케이터(초음파 처리 분해)의 에너지도 가열합니다. 샘플이 너무 뜨거워지면 단백질이 저하되기 시작합니다. 이 문제를 방지하기 위해 가능한 경우, 전, 후 및 도중에 항상 샘플을 얼음에 보관하십시오.
  2. 펄스로 시료의 온도를 낮추십시오. 대부분의 소니케이터에는(초음파 처리 분해) 초음파 검사 중 샘플의 가열을 줄이는 펄스 모드가 있습니다. 펄스가 옵션이 아니거나 사용할 수 없는 경우 소니케이터(초음파 처리 분해)를 5초 동안 켠 다음 끕니다. 필요에 따라 여러 번 반복하십시오.
  3. 소니케이트(초음파 처리 분해) 하지 마십시오. 샘플을 너무 오랫동안 소각하면 단백질이 저하될 수 있습니다. 완벽한 균형을 찾는 데는 약간의 최적화가 필요할 수 있으며 세포/조직 유형 및 샘플 용량에 따라 달라질 수 있습니다.
  4. 샘플 볼륨 및 프로브 크기. 사용하는 프로브는 샘플 크기에 따라 다를 수 있습니다. 각 프로브에는 권장되는 샘플 부피 범위가 있습니다. 소형 팁 (마이크로 팁) 은 작고 얇은 용기 내에서 샘플을 가공할 때 권장되며 50ml를 초과하는 샘플은 절대로 사용하지 않습니다. 마이크로 팁은 짧은 처리 시간을 위해 만들어집니다. 마이크로 팁은 소량으로 상당한 양의 열을 발생하므로 열 축적을 방지하기 위해 펄스 모드에서 사용해야합니다.
  5. 귀를 보호하십시오. 초음파 소음이 초음파이고 사람의 청각 범위를 벗어나더라도 소음에 의해 생성되는 작은 캐비테이션 버블이 붕괴되면 시끄러운 소음이 발생합니다. 적절한 귀 보호 장치를 착용하고 귀를 감싸는 것이 좋습니다.
  6. 거품을 제한하십시오. 프로브가 샘플에 제대로 잠겨 있지 않으면 거품이 발생할 수 있지만 너무 깊으면 적절한 용해를 얻을 수 없습니다. 당신이 어떤 거품이 당황하지 않으면, 나는 면역 항진, 웨스턴 블로 팅 또는 ELISA 분석을 수행 할 때 거품이 문제가 없다는 것을 발견했습니다.
  7. 진폭에 올 때 느리고 꾸준히 경주에서 승리합니다. 모든 실험과 마찬가지로 서부 전압에서 맥스뮴 전압을 높이거나 절반으로 세포를 변형하려는 유혹이 강합니다. 그러나 이것은 항상 공개 할 수있는 결과를 신경 쓰지 않습니다. 초음파의 경우 진폭이 낮을수록 샘플의 가열이 줄어 듭니다. 진폭과 강도는 직접적인 관계가 있습니다. 결과를 재현하기 위해 샘플의 진폭 설정, 온도, 점도 및 부피는 모두 일관되게 유지해야 하는 파라미터입니다. 음파 결과를 재현하려고 할 때 전력이 아닌 진폭이 가장 중요합니다.
  8. 샘플 사이에서 항상 소니레이터 (초음파 처리 분해) 팁을 청소하십시오. 소니케이터 (초음파 처리 분해) 팁을 청소하는 것은 단백질 이송을 제한하는 데 중요합니다. 소니레이터 (초음파 처리 분해) 프로브를 70% 에탄올로 닦거나 비커에서 에탄올을 소니케이터로 소니케이터 팁을 효과적으로 청소할 수 있습니다.