サンドイッチELISA

図1:サンドイッチELISAの概略図。これにより、捕捉抗体と検出抗体が目的のタンパク質に結合します。

サンドイッチELISAとは何ですか 。

サンドイッチELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)は、研究者がサンプル中の目的のタンパク質、ホルモン、または分析物の量を定量化できる抗体ベースの技術です。 捕捉抗体と検出抗体は、タンパク質の非重複エピトープに結合してタンパク質を挟み込むため、サンドイッチELISAと呼ばれます。 検出抗体の添加に続いて、化学基質(TMBなど)を追加して、ELISAプレートリーダーで読み取ることができる比色シグナルを生成します。

サンドイッチELISA抗体

サンドイッチELISAの作成に使用される抗体は、検出される特異性、感度、および分析対象物に応じて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかになります。

> ポリクローナル抗体

ポリクローナル抗体は、多くの場合、サンプル中の可能な限り多くの検体をプルダウンするために使用されます。 したがって、ポリクローナル抗体はエピトープの複数のファセットに結合できるため、目的のタンパク質を検出するための捕捉機会が増加します。

> モノクローナル抗体

モノクローナル抗体により、研究者は単一の抗原をプルダウンできます。 したがって、研究者がタンパク質の微妙な違いを区別できるようにします。 また、モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体と比べてデータの一貫性が向上しています。

サンドイッチELISAの利点

長所 説明

サンプルの精製は不要

サンドイッチELISAアッセイは、精製を必要とせずに複雑なサンプルのタンパク質/分析物の測定を可能にします。

高い特異性

捕捉抗体と検出抗体が使用されるため、サンドイッチELISAアッセイは、直接または間接ELISAアッセイに比べて感度が向上しています。

定量化

ウェスタンブロットなどの他のEIAメソッドと比較して、サンドイッチELISAアッセイでは、研究者がサンプル中のタンパク質の量を定量化できます。

サンドイッチELISAキット

PharmaGenieサンドイッELISAキット

ELISAジェニのPharmaGenie ELISAキットは、製薬およびバイオテクノロジー研究のニーズを満たすように設計された高品質のELISAキットです。 PharmaGenie ELISAキットは、ISO 9001:2000品質システムに従って検証された高品質のモノクローナル抗体ペアと試薬に焦点を当てており、私たちの未来を発見するのに役立つ優れたアッセイです。

Human IL-2 PharmaGenie ELISA Kit
Human TNF-alpha PharmaGenie ELISA Kit
Human IFN-gamma PharmaGenie ELISA Kit

SuperSet Sandwich ELISA Kits (Development ELISA Kits)

サンドイッチELISAビデオ

サンドイッチELISAアッセイは、研究者が血清、血漿、細胞上清、組織、その他の生体サンプルなどのサンプルに含まれる目的のタンパク質を定量するのに役立ちます。 サンドイッチエリサキットは、キャプチャー抗体がポリスチレンELISAプレート上に既にコーティングされているプレコートELISAプレートとして、または独自のELISAサンドイッチアッセイを開発するために抗体ペアを購入して、2つの形式で購入できます。 以下では、両方のプロトコルについて説明します。

サンドイッチELISAプロトコル

サンドイッチELISAアッセイは、研究者が血清、血漿、細胞上清、組織、その他の生体サンプルなどのサンプルに含まれる目的のタンパク質を定量するのに役立ちます。サンドイッチELISAキットは、キャプチャー抗体がポリスチレンELISAプレートに既にコーティングされているプレコートELISAプレートとして、または独自のELISAサンドイッチアッセイを開発するために抗体ペアを購入できる2つの形式で購入できます。以下では、両方のプロトコルについて説明します。

サンプルの準備と収集

さまざまな種類のサンプルを使用して、サンドイッチELISAでタンパク質/検体レベルを測定できます。

ベストプラクティスに従って、タンパク質を抽出し、サンプル収集後できるだけ早く実験を実行します。 または、指定された温度(-20°C / -80°C)で抽出物を保存し、最適な結果を得るために凍結融解サイクルの繰り返しを避けます。

血清:血清分離チューブを使用する場合、サンプルを室温で30分間凝固させます。 1,000x gで10分間遠心します。 血清画分を収集し、迅速に分析するか、一定分量にしてサンプルを-80℃で保存します。 複数回の凍結融解サイクルを避けてください。

血清分離チューブを使用しない場合は、サンプルを2〜8℃で一晩凝固させます。 1,000x gで10分間遠心します。血清を除去し、速やかにアッセイするか、アリコートしてサンプルを-80°Cで保存します。複数回の凍結融解サイクルを避けてください。

血漿:EDTAまたはヘパリンを抗凝固剤として使用して血漿を採取します。 採取から30分以内に、サンプルを4°Cで1000×gで15分間遠心します。 血漿分画を収集し、迅速に分析するか、一定分量にしてサンプルを-80℃で保存します。 複数回の凍結融解サイクルを避けてください。 注:溶血しすぎたサンプルは使用に適していません。

さまざまなサンプルタイプの詳細については、サンプル収集ガイドをご覧ください。

サンドイッチELISA(プレコート)プロトコルの段階的な手順

図3:プレコートエリサプレートのサンドイッチエリサプロトコル。 サンドイッチELISAアッセイに含まれるステップのステップごとの概略図。 まず、標準液を調製し、その後、エリサプレートにサンプルを加えてインキュベートします。 インキュベートしたら、プレートを洗浄し、標識抗体を加えてインキュベートします。 インキュベーション後、プレートを洗浄し、SABCワーキングソリューションを追加します。 プレートを洗浄し、TMB基質を加えた後、インキュベーションします。 最後に、停止ソリューションと測定を追加します。

ステップ 手順

1.

プレコートされたプレートに標準、試験サンプル、およびコントロール(ゼロ)ウェルをそれぞれ設定し、それらの位置を記録します。 各標準とサンプルを重複して測定することをお勧めします。 標準、サンプル、コントロール(ゼロ)ウェルを追加する前にプレートを2回洗浄してください!

2.

標準ウェルにアリコート0.1ml標準溶液。

3.

0.1 mlのサンプル/標準希釈バッファーをコントロール(ゼロ)ウェルに追加します。

4.

0.1 mlの適切に希釈したサンプル(ヒト血清、血漿、組織ホモジネート、その他の生体液)をテストサンプルウェルに加えます。

5.

カバーでプレートを密封し、37℃で90分間インキュベートします。

6.

カバーを取り外してプレートの内容物を廃棄し、吸収性濾紙またはその他の吸収性材料の上でプレートをたたきます。 ウェルをいつでも完全に乾燥させないでください。 洗浄プレートX2。

7.

0.1 mlのビオチン検出抗体ワーキング溶液を上記のウェル(標準、テストサンプル、ゼロウェル)に追加します。 側壁に触れることなく、各ウェルの底にソリューションを追加します。

8.

カバーでプレートを密閉し、37℃で60分間インキュベートします。

9.

. カバーを取り外し、洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。 各洗浄の間に1分間、洗浄バッファーをウェルに置いてください。

10.

0.1 mlのSABC作業液を各ウェルに加え、プレートを覆い、37℃で30分間インキュベートします。

11.

カバーを取り外し、プレートを洗浄バッファーで5回洗浄し、そのたびに洗浄バッファーをウェルに1〜2分間放置します。

12.

90 µlのTMB基質を各ウェルに加え、プレートを覆い、暗所で15〜30分以内に37℃でインキュベートします。 (注:このインキュベーション時間は参照専用です。最適な時間はエンドユーザーが決定する必要があります。)青の色合いは最初の3〜4ウェル(ほとんどの標準溶液が濃縮されている)で見ることができます。 明らかな色はありません。

13.

50 µlの停止液を各ウェルに加え、完全に混合します。 色がすぐに黄色に変わります。

14.

O.Dを読む 停止液を加えた直後のマイクロプレートリーダーでの450 nmでの吸光度。

サンドイッチELISA(開発)プロトコルの手順

図4:開発エリサキットのサンドイッチエリサプロトコル。 サンドイッチエリサアッセイに含まれるステップのステップごとの概略図。

捕捉抗体を含むコーティングプレート

ステップ 手順

1.

希釈したキャプチャ抗体100µlをすべてのウェルに加えます。

2.

プラスチックプレートカバーで覆い、4℃で一晩インキュベートします。

3.

カバーを取り外し、次のようにプレートを洗浄します。
a) 各ウェルから液体を吸引します・
b) 0.3 mlの洗浄液を各ウェルに分注します。
c) 各ウェルの内容物を吸引します。
d) ステップbとcを繰り返します

4.

すべてのウェルに100µlのブロッキングバッファーを加えます。

5.

プラスチックプレートカバーで覆い、室温(18〜25℃)で2時間インキュベートします。

6.

カバーを取り外し、次のようにプレートを洗浄します。
a)各ウェルから液体を吸引します。
b)0.3 mlの洗浄液を各ウェルに分注する。
c)各ウェルの内容物を吸引します。、
d)ステップbとcをさらに2回繰り返します。

7.

プレートをすぐに使用するには、次のセクションに進んでください。

コーティングおよびブロックされたプレートを将来の使用のために保管する場合、各プレートを室温(18〜25°C)で24時間ベンチ乾燥させます。 その後、乾燥剤入りの密封されたビニール袋に2〜8℃で最大12か月保管します。

開発サンドイッチELISAプロトコル

ステップ 手順

1.

標準曲線を準備します。

2.

各標準液、サンプル、ゼロ(標準希釈バッファー)100µlを適切なウェルに複製して加えます。

3.

希釈した検出抗体50μlをすべてのウェルに加えます。

4.

プラスチックプレートカバーで覆い、室温(18〜25℃)で1時間インキュベートします。

5.

カバーを取り外し、次のようにプレートを洗浄します。
a)各ウェルから液体を吸引します。
b)0.3 mlの洗浄液を各ウェルに分注する、
c)各ウェルの内容物を吸引します、
d)ステップbとcを繰り返します。

6.

すべてのウェルにストレプトアビジン-HRP溶液100μlを追加します。

7.

プラスチックプレートカバーで覆い、室温(18〜25°C)で30分間インキュベートします。

8.

洗浄ステップ5を繰り返します。

9.

すぐに使用できるTMB基質溶液100μlをすべてのウェルに加えます。

10.

すぐに使用できるTMB基質溶液100μlをすべてのウェルに加えます。

11.

すべてのウェルに100μlの停止試薬を加えます。

12.

450 nmを主波長として使用し、オプションで630 nmを基準波長として使用する分光光度計で(ステップ11の直後)各ウェルの吸光度値を読み取ります(610 nm〜650 nmが許容されます)。

検出とデータ分析

ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)とアルカリホスファターゼは、サンドイッチエリサ法による分析物の検出に最も広く使用されている酵素であり、研究者に用途に応じて異なるオプションを提供します。

リン酸P-ニトロフェニル(pNPP)

pNPPはALP基質です。 pNPPの添加後、サンプルを室温で10〜30分間インキュベートします。 0.75M NaOHを加えて反応を停止し、405nmでサンプルを読み取ります。

過酸化水素

過酸化水素はHRPの基質であり、反応中に色が変化します。

TMB(3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン)

TRPは、HRPの存在下で過酸化水素が還元されると色が変化します。 反応を停止するために、硫酸が加えられ、反応により、エリサプレートリーダーで450nmで読み取れる色の変化が生じます。

結果の計算

次の式を使用して計算します。:

相対O.D.450 =(各ウェルのO.D.450)–(ゼロウェルのO.D.450)


標準曲線は、各標準液の相対O.D.450(Y)対標準液の各濃度(X)としてプロットできます。 サンプルの濃度は、標準曲線から決定できます。 カーブエキスパート1.3などのプロフェッショナルソフトウェアを使用することをお勧めします。

注:測定されたサンプルが希釈された場合、希釈係数に以下の濃度を掛けます希釈前の濃度を得るための補間。

Author: Seán Mac Fhearraigh PhD

Author: Seán Mac Fhearraigh PhD.