샌드위치 엘리사

샌드위치 ELISA의 개략도, 이에 캡처 항체 및 탐지 항체는 관심의 단백질에 바인딩 한.

그림 1:  샌드위치 ELISA의 개략도, 이에 캡처 항체 및 탐지 항체는 관심의 단백질에 바인딩 한.

샌드위치 ELISA 란 무엇입니까?

Sandwich ELISA (효소 연결 면역 흡착제 분석) 는 연구자가 샘플에서 관심 있는 단백질, 호르몬 또는 분석 물질의 양을 정량화할 수 있는 항체 기반 기술입니다. 포착 및 검출 항체는 단백질의 겹치지 않는 에피토프 (epitopes) 에 결합하여 단백질을 샌드위치합니다. 따라서 이름, 샌드위치 ELISA. 검출 항체를 첨가한 후, ELISA 플레이트 리더기로 판독할 수 있는 비색 신호를 생성하기 위해 화학 기판 (예: TMB) 을 첨가합니다.  

샌드위치 엘리사 항체

샌드위치 ELISA를 생성하는 데 사용되는 항체는 검출되는 특이성, 민감도 및 분석물에 따라 다클론 또는 단클론 항체가 될 수 있습니다.

> 폴리클론 항체

폴리클론 항체는 종종 샘플에서 가능한 한 많은 분석물을 끌어 내리는 데 사용됩니다. 폴리 클론 항체는 에피토페의 여러 측면에 결합 할 수 있으므로 관심있는 단백질을 검출하기위한 증가 된 캡처 기회를 제공합니다.

> 단클론 항체

단일 클론 항체는 연구자들이 단일 항원을 끌어 당길 수있게합니다. 따라서 연구자가 단백질의 미묘한 차이를 구별 할 수있게하십시오. 단일 클론 항체는 또한 폴리 클론 항체에 비해 데이터의 일관성을 증가시킨다.

샌드위치 ELISA의 장점

장점 설명

시료 정화 불필요

샌드위치 ELISA 분석은 정화 없이 복잡한 샘플에서 단백질/분석물을 측정할 수 있습니다.

높은 특이성

포획 및 검출 항체가 사용되기 때문에 샌드위치 ELISA 분석은 직접 또는 간접 ELISA 분석에 비해 민감도가 증가했습니다.

정량화

Sandwich ELISA 분석법을 사용하면 Western Blot 같은 다른 EIA 방법과 비교하여 연구원들은 샘플의 단백질 양을 정량화할 수 있습니다.

샌드위치 엘리사 키트

제약 샌드위치 ELISA 키트

ELISA Genie의 제약 ELISA 키트는 제약 및 생명 공학 연구의 요구를 충족하도록 설계된 고품질 ELISA 키트입니다. ISO 9001:2000 품질 시스템에 따라 검증된 고품질 단클론 항체 쌍과 시약에 초점을 맞춘 PharMagenie ELISA 키트는 우리의 미래를 발견하는 데 도움이 되는 우수한 분석법입니다.

인간 IL2 약리엘리사 키트

인간 TNF-알파 약리사 키트

인간 IFN 감마 약전 ELISA 키트

슈퍼세트 샌드위치 엘리사 키트 (개발 엘리사 키트)

인간 IL6 슈퍼세트 엘리사 키트

마우스 IL10 슈퍼세트 엘리사 키트

휴먼 아이캠-1/CD54 슈퍼세트 엘리사 키트

샌드위치 엘리사 비디오

ELISA Genie에서 우리는 인간, 마우스 및 쥐 대상을 포함한 인기 있는 ELISA 키트의 사용을 위한 주요 프로토콜 샌드위치 ELISA 비디오를 개발했습니다. 이 교육용 비디오는 ELISA 프로토콜의 주요 단계에 대해 논의하여 연구자들이 효율적으로 분석할 수 있도록 합니다. 프로토콜은 ELISA 키트에 따라 약간 다를 수 있습니다.

샌드위치 엘리사 프로토콜

샌드위치 ELISA 분석은 연구자들이 혈청, 혈장, 세포 상위제, 조직 및 기타 생물학적 샘플과 같은 샘플에서 관심 있는 단백질을 정량화할 수 있도록 도와줍니다. 샌드위치 ELISA 키트는 두 가지 형식으로 구입할 수 있습니다. 사전 코팅된 ELISA 플레이트로 포착 항체가 폴리스티렌 ELISA 플레이트에 코팅되어 있거나 항체 쌍을 구입하여 자신의 ELISA 샌드위치 해법을 개발할 수 있습니다. 아래에서는 두 프로토콜을 모두 설명합니다.

샘플 준비 및 수집

다양한 샘플 유형을 사용하여 Sandwich ELISA로 단백질/분석 물질 수준을 측정할 수 있습니다.

모범 사례에 따르면, 샘플 수집 후 가능한 한 빨리 단백질을 추출하고 실험을 수행하십시오. 또는 지정된 온도 (-20°C/-80°C) 에 추출물을 보관하고 최적의 결과를 얻으려면 반복적인 동결 해동 주기를 피하십시오.

혈청: 혈청 분리기 튜브를 사용하는 경우 시료가 실온에서 30분 동안 응고되도록 하십시오. 1,000x g에서 10 분 동안 원심 분리기. 혈청 분획을 수집하여 즉시 또는 유사하게 분석하여 시료를 -80°C로 보관하고 여러 번의 동결 해동 주기를 피하십시오.

혈청 분리기 튜브를 사용하지 않을 경우 2-8°C에서 시료를 밤새 응고시킬 수 있습니다. 1,000xg에서 10분 동안 원심분리기. 혈청을 제거하고 즉시 또는 알칼리성을 제거하고 시료를 -80°C 에 보관하고 여러 번의 동결 해동 주기를 피하십시오.

플라즈마: EDTA 또는 헤파린을 항응고제로 사용하여 혈장을 수집하십시오. 수집 후 30분 이내에 1000 × g에서 4°C에서 15분 동안 원심 분리 시료. 플라즈마 분획을 수집하여 즉시 또는 유사하게 분석하여 시료를 -80°C로 저장하십시오. 다중 동결 해동 주기를 피하십시오. 참고: 이상 용혈 샘플은 사용하기에 적합하지 않습니다.

다양한 샘플 유형에 대한 자세한 내용은 샘플 수집 가이드를 참조하십시오.

샌드위치 ELISA (사전 코팅) 프로토콜 단계별

미리 코팅 된 ELISA 플레이트에 대한 샌드위치 ELISA 프로토콜. 샌드위치 ELISA 애세이에 관련된 단계에 대한 단계별 도식입니다. 첫째, 표준을 준비한 다음 ELISA 플레이트 및 인큐베이트에 샘플을 첨가합니다. 배양되면 플레이트를 씻은 다음 라벨이 붙은 항체 및 인큐베이트를 넣습니다.

그림 3: 미리 코팅 된 ELISA 플레이트에 대한 샌드위치 ELISA 프로토콜. 샌드위치 ELISA 애세이에 관련된 단계에 대한 단계별 도식입니다. 첫째, 표준을 준비한 다음 ELISA 플레이트 및 인큐베이트에 샘플을 첨가합니다. 배양되면 플레이트를 씻은 다음 라벨이 붙은 항체 및 인큐베이트를 넣습니다. 배양 후 플레이트를 씻고 SABC 작업 솔루션을 추가하십시오. 플레이트를 씻고 TMB 기판을 넣은 다음 배양기를 넣습니다. 마지막으로 중지 솔루션 및 측정을 추가하십시오.

단계 절차

1.

사전 코팅 플레이트에 표준, 시험 샘플 및 제어 (제로) 우물을 각각 설정한 다음 위치를 기록합니다. 각 표준과 샘플을 중복으로 측정하는 것이 좋습니다. 표준, 시료 및 제어 (제로) 우물을 추가하기 전에 판을 두 번 세척하십시오!

2.

표준 웰에 0.1ml 표준 솔루션을 알리쿼트.

3.

0.1ml의 시료/표준 희석 버퍼를 제어 (제로) 우물에 추가합니다.

4.

시험 시료 웰에 적절하게 희석된 샘플 (인간 혈청, 혈장, 조직 균질화 및 기타 생물학적 유체) 0.1ml를 넣으십시오.

5.

덮개로 플레이트를 밀봉하고 37°C에서 90분 동안 배양합니다.

6.

커버를 제거하고 플레이트 내용물을 버리고 흡수성 필터 용지 또는 기타 흡수성 물질에 판을 박수 치십시오. 우물을 언제든지 완전히 말리지 마십시오. 세척 플레이트 x2.

7.

위의 우물 (표준, 시험 샘플 및 제로 웰) 에 바이오틴 검출 항체 작업 용액 0.1 ml를 추가합니다. 측벽을 건드리지 않고 각 우물의 하단에 솔루션을 추가하십시오.

8.

덮개로 플레이트를 밀봉하고 37°C에서 60분 동안 배양합니다.

9.

덮개를 제거하고 세척 완충기로 3 번 판을 씻으십시오. 각 세척 사이에 1 분 동안 우물에 세척 버퍼 나머지를 보자.

10.

각 웰에 0.1 ml의 SABC 작업 용액을 넣고 플레이트를 덮고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.

11.

덮개를 제거하고 세척 판을 5 회 워시 버퍼와 함께, 때마다 워시 버퍼가 우물에 머물러있게 1-2 분.

12.

각 우물에 90µl의 TMB 기판을 넣고 플레이트를 덮고 15-30분 이내에 어두운 곳에서 37°C에서 배양합니다. (참고: 이 잠복기는 참조 용이며 최종 사용자가 최적 시간을 결정해야 합니다.) 그리고 파란색의 음영은 첫 번째 3-4 개의 우물 (가장 집중된 표준 솔루션 포함) 에서 볼 수 있으며, 다른 우물은 명백한 색을 보이지 않습니다.

13.

각 우물에 50 µl의 스톱 용액을 넣고 철저히 혼합합니다. 색상이 즉시 노란색으로 바뀝니다.

14.

정지 용액을 첨가한 직후 마이크로 플레이트 리더기에서 450nm의 O.D. 흡수도를 읽습니다.

샌드위치 ELISA (개발) 프로토콜 단계별

개발 ELISA 키트 샌드위치 ELISA 프로토콜. 샌드위치 ELISA 애세이에 관련된 단계에 대한 단계별 도식입니다.

그림 4: 개발 ELISA 키트 샌드위치 ELISA 프로토콜. 샌드위치 ELISA 애세이에 관련된 단계에 대한 단계별 도식입니다. (Loopi = 100PI)

Coating plate with capture antibody

단계 절차

1.

모든 우물에 100µl의 희석된 포획 항체를 첨가하십시오.

2.

플라스틱 플레이트 커버로 덮고 밤새 4°C에서 배양하십시오.

3.

덮개를 제거하고 다음과 같이 판을 씻으십시오:
a) 각 우물에서 액체를 흡인하십시오.
b) 각 우물에 0.3 ml의 세척액을 분배하십시오
c) 각 우물의 내용물을 흡인하십시오.
d) b 및 c 단계를 반복하십시오.

4.

모든 우물에 100µl의 블로킹 버퍼를 추가하십시오.

5.

플라스틱 플레이트 커버로 덮고 실온 (18~25°C) 에서 2시간 동안 배양하십시오.

6.

덮개를 제거하고 다음과 같이 판을 씻으십시오:
a) 각 우물에서 액체를 흡인하십시오.
b) 각 우물에 0.3 ml의 세제 용액을 분배하십시오
c) 각 우물의 내용물을 흡인하십시오.
d) b 단계와 c 다른 2 번 반복하십시오.

7.

플레이트를 즉시 사용하려면 다음 섹션으로 이동하십시오.

나중에 사용할 수 있도록 코팅된 플레이트와 차단 플레이트를 보관하려면 각 플레이트를 실온 (18~25°C) 에서 24시간 동안 벤치식 건조시킵니다. 그런 다음 2-8°C에서 건조제를 넣은 밀봉된 비닐 봉지에 최대 12개월 동안 보관하십시오.

샌드위치 엘리사 프로토콜

단계 절차

1.

표준 곡선을 준비합니다.

2.

각 표준, 샘플, 제로 (표준 희석 버퍼) 의 100µl을 중복된 적절한 웰에 추가합니다.

3.

50μl의 희석된 검출 항체를 모든 우물에 첨가하십시오.

4.

플라스틱 플레이트 커버로 덮고 실온 (18~25°C) 에서 1시간 동안 배양하십시오.

5.

덮개를 제거하고 다음과 같이 판을 씻으십시오:
a) 각 우물에서 액체를 흡인하십시오.
b) 각 우물에 0.3 ml의 세척액을 분배하십시오
c) 각 우물의 내용물을 흡인하십시오.
d) b 및 c 단계를 반복하십시오.

6.

모든 우물에 스트렙타비진 - HRP 용액 100μl을 추가합니다.

7.

플라스틱 플레이트 커버로 덮고 실온 (18~25°C) 에서 30분 동안 배양하십시오.

8.

세척 단계를 반복합니다. 5.

9.

즉시 사용할 수 있는 TMB 기판 솔루션 100μl을 모든 유정에 추가합니다.

10.

실온에서 5-15 분* 동안 어둠 속에서 부양하십시오. 플레이트를 알루미늄 호일에 싸서 빛에 직접 노출시키지 마십시오.

11.

모든 우물에 정지 시약 100μl을 추가합니다.

12.

기본 파장으로 450nm을 사용하고 선택적으로 630nm을 기준 파 길이로 사용하는 분광 광도계에서 각 우물의 흡수율 값 (11단계 직후) 을 읽습니다 (610nm ~ 650nm 허용).

탐지 및 데이터 분석

말 무 퍼 옥시다제 (HRP) 및 알칼리 포스 파타 아제는 샌드위치 ELISA 방법으로 분석물을 검출하기 위해 가장 널리 사용되는 효소이며 응용 분야에 따라 연구자에게 다양한 옵션을 제공합니다.

P-니트로페닐 인산염

PnPP는 ALP 기판입니다. PnPP를 추가 한 후 실온에서 10-30 분 동안 샘플을 배양하십시오. 0.75M의 NaOH를 추가하고 405nm에서 샘플을 판독하여 반응을 중지합니다.

과산화수소

과산화수소는 HRP의 기질이며 반응 중에 색 변화를 허용합니다.

테트라멜벤지딘 테트라메틸벤지딘

TMB는 HRP의 존재 하에서 과산화수소의 환원에 따라 색 변화를 겪습니다. 반응을 냉각시키기 위해 황산을 첨가하고 반응은 ELISA 플레이트 리더기를 통해 450nm에서 판독할 수 있는 색상 변화를 가져옵니다.

결과 계산하기

다음 방정식을 사용하여 계산합니다.

상대 O.D.450 = (각 우물의 O.D.450) — (제로 우물의 O.D.450)


표준 곡선은 각 표준 솔루션 (Y) 의 상대 O.D.450 대 표준 솔루션의 각 농도 (X) 로 플롯할 수 있습니다. 샘플의 농도는 표준 곡선에서 결정할 수 있습니다. 곡선 전문가 1.3과 같은 전문 소프트웨어를 사용하는 것이 좋습니다.

참고: 측정된 시료를 희석한 경우, 희석
하기 전에 농도를 얻기 위해 보간에서 농도에 희석 인자를 곱합니다.

Author: Seán Mac Fhearraigh PhD. Translated by Dohee Kim.