ELISA バッファーとレシピ

ブロッキングバッファー

ブロッキングバッファーは、コーティングタンパク質によって占有されていないプレートの表面に非特異的に結合する非特異的タンパク質、タンパク質または化合物の混合物の溶液です。

ブロッキングバッファーは、バックグラウンドとS / N比を下げることでELISAアッセイの感度を向上させる場合に効果的です。

理想的なブロッキングバッファーはすべての非特異的部位に対するものであるため、バックグラウンドを排除し、抗体結合の分析対象エピトープを不明瞭にすることなく非特異的シグナルを低減します。

ブロッキングバッファのレシピ

リン酸緩衝生理食塩水(PBS)

1% BSA

コーティングバッファー

エリサコーティングバッファーを使用して、タンパク質/分析物または抗体をマイクロタイタープレートに固定します。 マイクロタイタープレートへの検体/抗体の固定化における重要な要因は、コーティングバッファーのpHです。 pH 7.4とpH 9.6の間のコーティングバッファーを選択すると、タンパク質/抗体/分析物の結合の立体構造に影響を与える可能性があり、したがってそれらの固定に影響します。 コーティングバッファーのテストは、固定化抗体の移動性とパフォーマンスの向上に役立ちます。

コーティングバッファーのレシピ(1L)

Na₂CO₂

1.5g

NaHCO₃

2.93g

蒸留水

pH 9.6

推奨基板と停止ソリューション

TMB

HRP(西洋わさびペルオキシダーゼ)共役酵素の存在下で、TMBと過酸化物が反応して、605 nmで最大の吸光度を持つ青色の副産物を生成します。 HRP活性によって生成される色の強度は、ELISAアッセイの分析対象物のレベルに比例します。 TMB(3,3 '、5,5' –テトラメチルベンジジン)インキュベーション後、0.16M硫酸の停止溶液を加えて反応を停止します。 追加する停止液の量は、ELISAプレートの各ウェルに追加するTMB基質の量と同じにする必要があります(通常、ウェルあたり50〜100 uL)。 硫酸停止溶液の添加後。 色が青から黄色に変化し、発色が安定し、分光光度計を使用して450nmでの強度を正確に測定できます。

PNPP(リン酸p-ニトロフェニル)

pNPPは、アルカリホスファターゼの発色基質です。 アルカリ性リン酸結合抗体で使用するためのpNPP。 アルカリホスファターゼは、pNPPからpNPへの加水分解を触媒します。 これにより、405nmで最大の吸収を持つ黄色のフェノラートが生成されます。 pNNPは光に敏感であるため、保護する必要があります。

洗浄バッファー

エリカ洗浄の目的は、シグナル伝達を変える破片を除去し、ELISA成分を保存することです。 ELISAプレートは、標準およびサンプルの添加前、検出抗体の添加後、およびHRPコンジュゲート抗体の添加後に洗浄されます。 ELISAプロトコールでは、TrisベースとPBSベースの両方の洗浄バッファーを使用できます。

PBS洗浄バッファー

材料

PBS

0.05% V/V トゥイーン-20

トリスベースの洗浄バッファー

成分(1Lのバッファーのレシピ)

6.06gトリスベース

8.2g NaCl

6.0ml 6 M HCL

蒸留水 1L

pHは7.2〜7.8、導電率は14,000〜16,000でなければなりません

洗浄液

成分(溶液1L)

TBS 1L

5 mlの10%トゥイーン 20

Author: Seán Mac Fhearraigh PhD.