ELISAアッセイ、原理、プロトコル、方法、キット

ELISAアッセイとは何ですか 。

ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)は、生体サンプル中のタンパク質、ペプチド、ホルモン、または化学物質のレベルを測定する抗体ベースの技術です。サンドイッチELISAアッセイでは、捕獲抗体を96ウェルプレートの表面に固定します。その後、目的の検体を含むサンプルを添加し、抗体とサンプルの複合体を形成します。インキュベーションステップに続いて、洗浄バッファーを使用してウェルを洗浄し、未結合の検体を除去します。酵素に結合した検出抗体を添加すると、検出が行われます。インキュベーション後、余分な抗体と非特異的な結合タンパク質を除去するために、別の洗浄ステップが実行されます。その後、基質が追加され、比色の変化が起こります。サンプル中の分析物の量は、色の変化の強度の増加と相関しています。最後に、停止ソリューションが追加されます。プロトコルが完了したら、サンプルをELISAプレートリーダーで分析し、ソフトウェアプログラムを使用して結果をプロットおよび計算します。

Figure : Cartoon of 96 well polystyrene ELISA plate

ELISAアッセイプレート

ELISAアッセイは、96ウェルまたは384ウェルのポリスチレンプレートで実行されます。 タンパク質および抗体は、インキュベーション後に96ウェルELISAプレートに固定できます。 サンドイッチELISAアッセイでは、捕捉抗体がELISAプレートに固定されます。 ただし、競合エリサアッセイでは、対象の分析物がELISAプレートに結合されます。 次に、ELISAプレートをBSAブロッキング溶液でブロックして、ELISAアッセイ中の非特異的タンパク質の結合を防ぎます。


プレートへの抗体または分析物の結合により、洗浄バッファーによる洗浄ステップが可能になり、非特異的に結合する分析物の除去が可能になります。


ELISAプレートは平底で、プレートリーダーが450nmでELISAプレートリーダーで吸光度を読み取ることができます。

エイア vs ELISA

イムノアッセイは、抗体を使用して目的の抗原を検出するアッセイです。 EIA(酵素免疫測定法)は、検出された抗体に結合した酵素を使用して、検出と定量を可能にするアッセイです。 EIAの2つの例は、ウエスタンブロットとELISAです。 ウエスタンブロットは、ニトロセルロースまたはPVDFを使用してタンパク質を固定化するEIAです。 これに続いて、目的のタンパク質に結合する一次抗体を追加し、続いて酵素共役二次抗体とインキュベートして目的の検体を検出します。 ELISAアッセイでは、捕捉抗体をポリスチレンプレートに固定し、目的の分析物を含むサンプルをインキュベートした後、TMBを基質として検出抗体で検出し、比色分析を行います。

Figure : A Human IL-6 ELISA kit with a range of 4.69-300pg/ml and sensitivity of <2.813pg/ml

ELISAアッセイの感度と範囲

ELISAアッセイにより、研究者は既知の標準セットを使用して、定義された範囲内でサンプル(血清、血漿、上澄み、牛乳、尿)に含まれる分析物の量を決定できます。 ELISAアッセイを実施する場合、既知の濃度の検体をサンプル中の検体量のベンチマークとして使用します。これらは標準と呼ばれます。 ELISAアッセイでは、標準のストックが通常ng / mLまたはpg / mLの量で提供されます。その後、このストックを6〜7倍に希釈して、ある範囲の既知の濃度の検体を提供します。 値をプロットすると、標準曲線が作成され、サンプルの未知の濃度がこれらの値に対して計算されます。

高感度ヒトELISAキット

分析物 範囲 感度

1.87 pg/ml - 60 pg/ml

0.97 pg/ml

0.31 pg/ml - 10 pg/ml

0.31 pg/ml

1.56 pg/ml - 50 pg/ml

0.8 pg/ml

1.56 pg/ml - 50 pg/ml

1.30 pg/ml

0.78 pg/ml - 25 pg/ml

0.75 pg/ml

0.78 pg/ml - 25 pg/ml

0.69 pg/ml

ELISAアッセイの種類

研究者が日々の研究で使用するELISAアッセイには主に6つのタイプがあり、最も一般的なのはエリサポトおよび間接ELISAアッセイが続くサンドイッチ&競合エリサアッセイです。

> サンドイッチELISAアッセイ

サンドイッチELISAアッセイは、ELISAの最も一般的な形式であり、検出のために分析物を挟む捕捉および検出抗体の形成にちなんで命名されています。 上記のように、サンドイッチELISA¥アッセイは、ポリスチレンELISAプレートに固定化された捕獲抗体を持っています。 次に、サンプルをELISAプレートのウェルでインキュベートした後、洗浄ステップを行います。 次に、酵素結合検出抗体を加え、さらにインキュベーションを行い、最後に基質と停止溶液を加えて検体レベルを測定します。

サンドイッチELISAアッセイプロトコル

> 競合ELISAアッセイ

競合ELISAアッセイは、主にホルモンの検出に使用されます。 競合ELISAアッセイでは、対象の分析物をポリスチレンELISAプレートに固定します。 競合ELISAは、サンプル中の分析物が、捕捉抗体のプレート上の固定化分析物と競合するプロセスにちなんで命名されています。 したがって、サンプル中の検体の量が増えると、シグナルが減少し、サンドイッチELISAアッセイで見られるグラフと逆になります。

> エリスポト ELISAアッセイ

エリスポトアッセイは、一般に、ワクチン開発、獣医学研究、単球/マクロファージ/樹状細胞の特性評価に使用されます。 エリスポトの原理はサンドイッチELISAアッセイに似ており、プレートは捕捉抗体でコーティングされています。 その後、細胞をELISAプレートで最大3時間インキュベートします。これはアプリケーションによって異なります。 次に、細胞によって産生されたサイトカインは、ELISAプレートに固定化された捕捉抗体によって結合されます。 次に、細胞をELISAプレートから洗い流し、検出抗体を加えた後、基質を検出し、サイトカインを検出できるように溶液を停止します。

> FluoroSpot ELISA assay

A FluoroSpot ELISA assay is identical to an ELISpot ELISA, however, instead of using a enzyme-linked detection antibody, the detection antibody is conjugated with a fluorophore to allow for detection and analysis.

> フォロロスポトELISAアッセイ

フォロロスポトELISAアッセイはエリスポト エリサと同じですが、酵素結合検出抗体を使用する代わりに、検出抗体を蛍光団と結合させて検出と分析を可能にします。

> 間接ELISAアッセイ

間接ELISAアッセイでは、対象の分析物が一次捕捉抗体に結合します。 次に、二次抗体を使用して一次抗体を結合します。 これは、ウエスタンブロットアッセイの方法に似ています。

> 直接ELISAアッセイ

直接ELISA法はアッセイであり、酵素標識抗体を使用して溶液中の分析物に結合します。 結合すると、酵素標識抗体は基質と反応して色の変化をもたらし、分析物の定量化を可能にします。 これにより、捕捉抗体が両方の機能を実行するため、二次検出抗体が不要になります。

マルチプレックスELISAパネル

> CLIAアッセイ

CLIAアッセイは原則としてサンドイッチアッセイに似ていますが、サンプルの検出に発色基質を使用する代わりに、CLIAアッセイは化学発光に基づいています。 CLIAアッセイでは、検出抗体が基質を光に変換します。 生成される光子の量は、サンプル中の検体の量に比例します。 アッセイでサンプルの量を測定するには発光はルミノメーターによって相対光単位(RLU)で測定されます。

CLIAアッセイは通常、低濃度の分析対象物の検出に使用されます(検出限界=ゼプトモル10-21 mol)。

>インセルセッルELISA

In-Cell ELISAは間接的なELISA技術であり、ポリスチレンエリスプレート上で一晩培養および培養された細胞を使用して実行されます。 次に、細胞を固定、透過処理、ブロックします。 次に、酵素結合または蛍光標識された一次抗体を使用して、標的タンパク質を検出します。 蛍光標識された抗体は、蛍光プレートリーダーまたは顕微鏡による検出を可能にしますが、酵素結合二次抗体はプレートリーダーによる検出を可能にします。

ELISAの検出戦略

ELISAの検出ステップは、サンプルに含まれる検体の量を測定する最後のステップです。 検出ステップ中に生成される信号は、anの量に比例します。 ELISAでの検体の検出には3つのオプションがあります。 放射性(ラジオイムノアッセイ)または蛍光タグ、または発色基質の使用。

発色性は、ELISA検出で最も一般的で最も広く使用されている手法であり、酸化すると青色になり、その後に黄色に変わるホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)基質TMB(3、3 '、5、5'-テトラメチルベンジジン)が含まれます 硫酸の添加。 ELISAプレートリーダーで450nmでサンプルを読み取ることができます。

化学発光などの他の検出方法は、425 nmの光を発する基質としてルミノールを使用したHRPに基づいて使用できます。

プレコートELISAキットと開発抗体ペアELISAキットをすぐに使用可能

ELISA ジニでは、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、その他の1000種類のバイオマーカーを検出するための、すぐに使用できるプレコートELISAキットとELISA開発キットを提供しています。

ELISA ジニELISAキット

ELISA ジニ ELISAキットには、あらかじめコーティングされたELISAプレート、捕捉および検出抗体、洗浄バッファー、標準希釈バッファー、TMB、停止液が含まれています。 また、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシなど、さまざまな種のキットも提供しています。

高感度PharmaGenie ELISAキット

ELISA GenieのPharmaGenie ELISAキットは、製薬およびバイオテクノロジー研究のニーズを満たすように設計された高品質のELISAキットです。 ISO 9001:2000品質システムに従って検証された高品質のモノクローナル抗体ペアと試薬に焦点を当てたPharmaGenie ELISAキットは、未来を発見するのに役立つ優れたアッセイです。

  • すべての試薬がISO 9001:2000品質システムに従って検証されているため、精度と信頼性が保証されます
  • 天然および組換え抗原特異性の両方を認識
  • 試験した他のヒトサイトカインとの交差反応性なし
  • NIBSCへの標準キャリブレーション
  • 開発ELISAキット(抗体ペア)
  • 抗体ペアにより研究が可能

開発ELISAキット(抗体ペア)

開発ELISAキットにより、研究者は独自のELISAプレートを作成できます。 開発ELISAキットには、抗体ペア(一致する捕捉抗体と検出抗体)およびバッファーが付属しています。 これにより、研究者は独自のELISAキットをコーティングおよびめっきすることができます。 ELISA Genieは、SuperSet ELISAキットと呼ばれる高品質の開発用ELISAキットを幅広く提供しています。

  • 高度に最適化されたモノクローナル抗体ペア。
  • 一貫した標準曲線を生成するための高品質の精製組換えタンパク質。
  • 試薬は、ISO 9001:2000品質システムに従って検証されています。
  • 天然および組換え抗原の特異性。
  • 試験した他のサイトカインとの交差反応性はありません。
  • NIBSCの標準キャリブレーション。
  • 製薬およびバイオテクノロジー研究部門を念頭に置いて開発されたELISAキット。
  • 効率的な研究のためのさまざまなキットサイズ!

主要なスーパーセットELISA開発キット

スーパセット開発ELISAプロトコル

Figure: Overview of the protocol steps for a SuperSet Development ELISA protocol using antibody pairs.

開発ELISAキットとプレコートELISAキットの利点と機能

特徴 開発ELISAキット プレコートELISAキット 多重ELISA

読み出す

HRP-TMB

HRP-TMB

PE/APC

インキュベーション時間

2-3時間

2-3時間

2時間

感度

pg/ml

pg/ml

pg/ml

ウェルあたりのターゲット数

1

1

24

必要な計装

ELISAプレートリーダー

ELISAプレートリーダー

フローサイトメーター

ELISAの抗体タイプ

ELISAキットは、抗体の検出と捕捉にモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して作成されます。 モノクローナルは、単一のエピトープを認識するという利点を提供するため、特定の抗原の正確な分析を提供します。 しかし、ポリクローナルには、増加した量の抗原を捕捉するという利点があります。 最近、組換えモノクローナル抗体がELISAキットの作成に使用されているため、特異性と一貫性が向上しています。

ELISA Genie PharmaGenieシリーズのELISAキットは、IL-1ベータ、IFN-ガンマ、IL-2、IL-4、IL-6、CXCL8 / IL-8などの主要なサイトカインターゲット用の高品質モノクローナル抗体を使用して製造されています。

ブロッキングバッファー

> ブロッキングバッファーの最適化

ELISAアッセイプレートへのタンパク質の非特異的結合を防ぐため、ブロッキングバッファーを使用してプレートをコーティングします。 ELISAプレートの結合能力は、プレートにコーティングされたタンパク質(Capture Antibody / Antigen)の量よりも高くなっています。 したがって、後続のインキュベーションステップ中に抗体または他のタンパク質の非特異的結合を防ぐために、残りの領域をブロックする必要があります。 したがって、後続のステップで他のタンパク質または検出抗体と結合したり複合体を形成したりしないタンパク質を使用して、ブロッキングバッファーが使用されます。 したがって、ブロッキングバッファーは、非特異的タンパク質の結合を防止し、バックグラウンドノイズを低減するため、ELISA感度を高め、したがってS / N比を高めます。

ELISAの開発中に、アッセイを最適化し、S / N比を改善するために、いくつかの異なるブロッキングバッファーをテストする必要があります。 タンパク質の非特異的結合に影響を与える可能性のある要因は、タンパク質:タンパク質相互作用の形成です。 ブロックバッファーを最適化する場合の重要なポイントは、S / N比の増加を最適化することです。これは、ターゲット分析対象のサンプルを追加せずにコントロールウェルを使用することでわかります。

ブロッキングバッファーを最適化する場合は、抗体と抗原の相互作用を阻害したり、酵素活性を阻害する可能性があるブロッカーを過剰に使用しないことも重要です。 ブロッキング用に最適化する場合、最適な信号を最適化するために、いくつかのバッファをテストできます。

> コーティングバッファー

ELISAコーティングバッファーを使用して、タンパク質/分析物または抗体をマイクロタイタープレートに固定します。 マイクロタイタープレートへの検体/抗体の固定化における重要な要因は、コーティングバッファーのpHです。 pH 7.4とpH 9.6の間のコーティングバッファーを選択すると、タンパク質/抗体/分析物の結合の立体構造に影響を与える可能性があり、したがってそれらの固定に影響します。 コーティングバッファーのテストは、固定化抗体の移動性とパフォーマンスの向上に役立ちます。 1枚のプレートのSuperSet Development ELISAキットで、100µlのキャプチャー抗体を10mlのコーティングバッファーに加えます。

ブロッキングバッファのレシピ

リン酸緩衝生理食塩水(PBS)

1% BSA

コーティングバッファーレシピ(1L) 成分量

Na₂CO₂

1.5グラム

NaHCO₃

2.93グラム

蒸留水

1L (pH 9.6)

ELISA洗浄ステップ

インキュベーションステップに続いて、バックグラウンドシグナルを低減するために、結合した非特異的タンパク質および試薬を除去するための洗浄ステップが必要です。 各キットには、指定された量の洗浄ステップが必要です。 洗浄する場合、洗浄ステップの数が不十分であるとバックグラウンドが高くなりますが、逆に過剰洗浄は抗体および/または抗原をELISAプレートから除去する可能性があり、感度とシグナルが低下します。 プレートウォッシャーを使用した自動洗浄は、手動で洗浄ステップを実行するよりも効率的です。


洗浄ステップは、TBS(トリス緩衝生理食塩水)またはPBS(リン酸緩衝生理食塩水)を使用して実行されます。 さらに、0.5%Tween-20を追加して、非特異的な結合タンパク質を除去することができます。

ELISAデータの分析

ELISAプロトコルの完了後、次のステップはELISAプレートリーダーを使用してデータを取得して分析することです。

ELISAを実行する場合、結果の統計的有意性を確保するために、サンプルを2回または3回実行することをお勧めします。 さらに、標準などの陽性対照、既知の陽性対照、および目的の抗原を含まないブランクまたはサンプルなどの陰性対照が必要になる場合があります。

  • ネガティブコントロール:検体が存在しないサンプルポジティブコントロール:検体の
  • 在または量がわかっているサンプル。

使用するELISAのタイプ(定性的、半定量的または定量的)に応じて、データ出力は異なります。 したがって、分析するデータに基づいて、使用する特定のELISAを選択します。 データは、サンプルの対数濃度に対する光学密度(OD)のプロットとして表示されます。 既知の濃度の標準液を使用して、未知の分析物の濃度を決定できる標準曲線を作成します。

変動係数

変動係数は、結果の不一致と不正確さを識別するのに役立ちます。 平均に対する分散の割合として表されます。 分散が大きいほど、不整合とエラーが大きくなります。 係数変動(CV)は、標準偏差σと平均µの比です。:

Cv= σ/µ

  • 高CVは、次の一部またはすべてに起因します。:
  • ピペット操作の不正確さ
  • 細菌/真菌またはその他の試薬によるサンプル汚染。
  • 温度変動-ドラフトから離れた安定した温度でプレートをインキュベートする必要があります。
  • ウェルの乾燥-すべてのインキュベーションステップでプレートを覆う必要があります。

Author: Seán Mac Fhearraigh PhD