ELISA 분석법, 원리, 프로토콜, 방법 및 키트 | Elisa Genie

엘리사 (ELISA) 는 무엇입니까?

ELISA (효소 연결 면역 흡착제 분석) 는 생물학적 샘플에서 단백질, 펩타이드, 호르몬 또는 화학 물질의 수준을 측정하는 항체 기반 기술입니다. 샌드위치 ELISA 분석에서 포획 항체는 96 우물 플레이트의 표면에 고정되며, 그 다음에 관심있는 분석물을 포함하는 시료가 추가되고 항체와 시료 사이의 복합체가 형성됩니다. 인큐베이션 단계에 따라 웰은 워시 버퍼를 사용하여 세척되어 바인딩되지 않은 분석물을 제거합니다. 검출은 효소에 접합되는 검출 항체의 첨가에 따라 발생합니다. 배양 후 여분의 항체와 비특이적 결합 된 단백질을 제거하기 위해 또 다른 세척 단계가 수행됩니다. 그런 다음 기판이 추가되고 비색 변화가 발생합니다. 시료 내 분석물의 양은 색상 변화의 증가 강도와 관련이 있습니다. 마지막으로 중지 솔루션이 추가됩니다. 프로토콜이 완료되면ELISA 플레이트 리더에서 샘플을 분석하고 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결과를 플롯하고 계산합니다.

그림: 96 개에 폴리스티렌 ELISA 판의 그림

엘리사 어세이 플레이트

ELISA 분석은 96 또는 384 개의 우물 폴리스티렌 플레이트에서 수행됩니다. 단백질과 항체는 배양 후 96 우물 ELISA 플레이트에 고정시킬 수 있습니다. 샌드위치 ELISA 어세이 캡처 항체는 ELISA 플레이트에 고정된다. 그러나 경쟁 ELISA 분석에서 관심있는 분석자는 ELISA 판에 구속됩니다. 그런 다음 ELISA 플레이트를 BSA 차단 용액으로 차단하여 ELISA 검사에서 비특이적 단백질의 결합을 방지합니다.

항체 또는 분석물을 플레이트에 결합하면 세척 버퍼로 세척 단계를 수행할 수 있으므로 비특이적 결합 분석물을 제거할 수 있습니다.

ELISA 플레이트는 플레이트 리더가 ELISA 플레이트 리더기의 흡착도를 450nm에서 판독할 수 있도록 바닥이 평평합니다.

EIA vs ELISA

면역 측정법은 관심있는 항원을 검출하기 위해 항체를 사용하는 분석입니다. EIA (효소 면역 분석) 는 검출 된 항체에 접합된 효소를 사용하여 검출 및 정량화를 허용하는 분석입니다. EIA의 두 가지 예는 서부 오점과 ELISA 있습니다. 웨스턴 오점은 단백질을 불균형화하기 위해 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF를 사용하는 EIA입니다. 그 다음에는 관심 있는 단백질을 결합하기 위한 1차 항체를 첨가한 다음, 효소 공액-이차항체를 이용한 인큐베이션 (conjugated-secondary) 을 첨가하여 관심 있는 분석물을 검출합니다. ELISA 분석에서 포획 항체는 폴리스티렌 플레이트에 고정되고, 그 다음에 관심 있는 분석물이 포함된 시료를 배양한 다음 검출 항체를 통해 검출 및 TMB를 기판으로 사용한 비색 변화를 감지합니다.

그림: 4.69-300pg/ml의 범위와 2.813pg/ml 미만의 감도를 가진 Human IL-6 엘리사 키트

ELISA 분석의 민감도 및 범위

ELISA 분석을 통해 연구자들은 알려진 표준 세트를 사용하여 정의된 범위 내에서 샘플에 포함된 분석물 (혈청, 혈장, 상류제, 우유, 소변) 의 양을 확인할 수 있습니다. ELISA 분석을 수행할 때 알려진 분석물 농도는 샘플 내 분석물 양을 기준으로 사용됩니다. 이를 표준이라고 합니다. ELISA 분석 중에 표준 재고가 일반적으로 NG/ml 또는 pg/ml 양으로 제공되며, 이 스톡은 6-7 배 희석되어 용량에 분석물의 알려진 농도를 제공합니다. 값을 플롯할 때 표준 곡선이 생성되고 알 수 없는 샘플 농도가 이 값과 비교하여 계산됩니다.

고감도 인간 ELISA 키트

분석기 범위 감도

1.87 pg/ml - 60 pg/ml

0.97 pg/ml

0.31 pg/ml - 10 pg/ml

0.31 pg/ml

1.56 pg/ml - 50 pg/ml

0.8 pg/ml

1.56 pg/ml - 50 pg/ml

1.30 pg/ml

0.78 pg/ml - 25 pg/ml

0.75 pg/ml

0.78 pg/ml - 25 pg/ml

0.69 pg/ml


엘리사 분석의 종류

연구원들이 일상 연구에서 사용하는 6가지 주요 유형의 ELISA 분석이 있습니다. 가장 흔한 것은 샌드위치 & 경쟁 ELISA 분석법, EliSpot 및 간접 ELISA 분석법.

> 샌드위치 엘리사 어세이

샌드위치 ELISA 분석은 ELISA의 가장 일반적인 형태이며 검출을 위해 분석제를 샌드위치하는 캡처 및 검출 항체의 형성의 이름을 따서 명명됩니다. 위에서 언급했듯이, 샌드위치 ELISA 분석은 포획 항체를 폴리스티렌 ELISA 플레이트에 고정시켰습니다. 그런 다음 샘플을 ELISA 플레이트의 우물에서 배양한 다음 세척 단계를 따릅니다. 그런 다음 효소 연결 검출 항체를 첨가한 후 추가 배양 후 최종적으로 기판 및 정지 용액을 첨가하여 분석물 수준을 측정합니다.

샌드위치 엘리사 애세이 프로토콜

> 경쟁력 있는 엘리사 분석

경쟁 ELISA 분석은 주로 호르몬을 검출하는 데 사용됩니다. 경쟁력 있는 ELISA 분석에서 폴리스티렌 ELISA 플레이트에 고정된 관심있는 분석물을 분석합니다. 경쟁 ELISA는 포획 항체를 위해 플레이트에 고정된 분석제와 경쟁하는 시료의 분석물 공정의 이름을 따서 명명되었습니다. 따라서 샘플에서 분석물의 양이 증가하면 신호가 감소하고 Sandwich ELISA 분석에서 볼 수 있는 그래프와 반대가 됩니다.

> 엘리스폿 엘리사 어세이

EliSpot 분석은 백신 개발, 수의학 연구, 단핵구/대 식세포/수지상 세포의 특성 분석에 일반적으로 사용됩니다. EliSpot의 원리는 샌드위치 ELISA 검사와 유사하며, 플레이트는 포착 항체로 코팅됩니다. 세포는 ELISA 플레이트에서 최대 3 시간 동안 배양되며 이는 적용에 따라 달라질 수 있습니다. 세포에 의해 생성된 사이토카인이 ELISA 플레이트에 고정된 포획 항체에 의해 결합됩니다. 그런 다음 ELISA 플레이트에서 세포를 세척하고 검출 항체를 첨가한 다음 기판 및 정지 용액으로 사이토 카인을 검출할 수 있습니다.

> 불소 자리 엘리사 분석

FluoroSpot ELISA 분석은 EliSpot ELISA와 동일하지만, 효소와 연결된 검출 항체를 사용하는 대신 검출 항체와 결합시켜 검출 및 분석이 가능합니다.

> 간접 엘리사 어세이

간접적 인 ELISA 분석에서 관심있는 분석제는 1 차 포획 항체에 구속됩니다. 이차 항체는 기본 항체를 결합하는 데 사용됩니다. 이것은 서양 얼룩 분석의 방법과 유사합니다.

> 다이렉트 엘리사 어세이

직접 ELISA 기술은 분석으로, 효소 라벨이 붙은 항체가 용액의 분석제에 결합하는 데 사용됩니다. 일단 결합되면 효소 라벨이 붙은 항체는 기질과 반응하여 색 변화를 제공하여 분석물의 정량화를 가능하게 합니다. 포획 항체가 두 기능을 모두 수행하므로 2차 검출 항체가 필요하지 않습니다.

> 멀티플렉스 엘리사 어세이

다중플렉스 ELISA 분석을 통해 연구자들은 단일 샘플에서 여러 분석물을 분석할 수 있습니다. 이 기능은 연구자가 샘플에서 여러 사이토카인을 동시에 측정하려고 할 때 매우 유용합니다. 멀티플렉스 ELISA 분석은 흐름 사이토메트리, 플레이트 기반 멀티플렉스 또는 PVDF 또는 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 사용하는 등 다양한 형식을 통해 수행할 수 있습니다.

멀티플렉스 ELISA 패널

> 클리아 어세이

CLIA 분석은 원칙적으로 샌드위치 분석과 유사하지만 샘플 검출을 위해 염색성 기판을 사용하는 대신 CLIA 분석법을 사용합니다. CLIA 분석에서 검출 항체는 기판을 빛으로 변환합니다. 생성된 광자의 양은 샘플의 분석 물질 양에 비례합니다. 분석에서 샘플의 양을 측정하기 위해 발광은 광계로 상대 라이트 단위 (RLU) 로 측정됩니다.

CLIA 분석은 일반적으로 저농도 분석 물질의 검출에 사용됩니다 (검출 한계 = 제프토 몰 10-21 몰).

> 셀 엘리사

In-Cell ELISA는 간접 ELISA 기법이며, 밤새 폴리스티렌 ELISA 플레이트에 도금되고 배양된 셀을 사용하여 수행됩니다. 그런 다음 세포가 고정되고 투과되고 차단됩니다. 표적 단백질은 효소 접합되거나 형광 태그가 지정된 일차 항체를 사용하여 검출됩니다. 형광 태그가 지정된 항체는 형광판 판독기 또는 현미경으로 검출 할 수 있지만 효소 접합된 이차 항체는 플레이트 판독기에 의해 검출 할 수 있습니다.


ELISA에 대한 탐지 전략

ELISA의 검출 단계는 샘플에 있는 분석물의 양을 측정하는 마지막 단계입니다. 검출 단계에서 생성된 신호는 의 양에 비례합니다. ELISA에서 분석 물질을 검출하기위한 세 가지 옵션이 있습니다. 방사성 (방사성 면역 분석) 또는 형광 태그 또는 염색체 기판 사용.

염색제는 ELISA 검출을 위해 가장 인기 있고 가장 널리 사용되는 기법이며 말 무 과산화 효소 (HRP) 기질 TMB (3, 3, 5, 5'-테트라메틸벤지딘) 를 포함하며 산화되면 파란색을 산출하고 황산을 첨가한 후 황색으로 변합니다. ELISA 플레이트 리더에서 샘플을 450nm에서 판독할 수 있습니다.

화학분광과 같은 다른 검출 방법은 Luminol을 425nm에서 빛을 방출하는 기판으로 사용하는 HRP를 기반으로 사용할 수 있습니다.

사전 코팅된 ELISA 키트 및 개발 항체 페어 ELISA 키트 사용 가능

ELISA Genie는 사이토카인, 화학 카인, 호르몬, 신호 단백질 및 기타 1000개의 바이오마커를 검출하기 위해 사전 코팅된 ELISA 키트와 ELISA 개발 키트를 제공합니다.

엘리사 지니 엘리사 키트

ELISA Genie ELISA 키트에는 사전 코팅된 ELISA 플레이트, 포착 및 검출 항체, 세척 버퍼, 표준 희석 버퍼, TMB, 정지 용액이 들어 있습니다. 우리는 또한 인간, 쥐, 쥐, 돼지 고기, 소 등을 포함한 다양한 종의 키트를 제공합니다.

고감도 약전 ELISA 키트

ELISA Genie의 제약 ELISA 키트는 제약 및 생명 공학 연구의 요구를 충족하도록 설계된 고품질 ELISA 키트입니다. ISO 9001:2000 품질 시스템에 따라 검증된 고품질 단클론 항체 쌍과 시약에 초점을 맞춘 PharMagenie ELISA 키트는 우리의 미래를 발견하는 데 도움이 되는 우수한 분석법입니다.

  • 모든 시약이 ISO 9001:2000 품질 시스템에 따라 검증되었으므로 정확성과 신뢰성이 보장됩니다.
  • 천연 항원 및 재조합 항원 특이성 모두 인식
  • 테스트된 다른 인간 사이토카인과의 교차 반응성 없음
  • NIBSC에 대한 표준 교정
  • 개발 ELISA 키트 (항체 페어)
  • 항체 쌍은 연구를 허용

개발 ELISA 키트 (항체 페어)

개발 ELISA 키트를 통해 연구자들은 자신의 ELISA 플레이트를 만들 수 있습니다. 개발 ELISA 키트는 항체 쌍과 (일치하는 포착 및 검출 항체) 버퍼와 함께 제공됩니다. 이를 통해 연구자들은 자신의 ELISA 키트를 코팅하고 플레이할 수 있습니다. ELISA 지니는 슈퍼 세트 ELISA 키트라는 고품질의 개발 ELISA 키트의 범위를 제공합니다.

  • 고도로 최적화된 단클론 항체 쌍입니다.
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  • 시약은 ISO 9001:2000 품질 시스템에 따라 검증되었습니다.
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  • NIBSC에 대한 표준 교정.
  • ELISA Kit는 제약 및 생명 공학 연구 부문을 염두에 두고 개발되었습니다.
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주요 슈퍼세트 ELISA 개발 키트

슈퍼세트 개발 엘리사 프로토콜

그림: 항체 쌍을 사용하여 SuperSet 개발 ELISA 프로토콜에 대한 프로토콜 단계의 개요


개발 ELISA 키트 및 사전 코팅 ELISA 키트의 이점 및 특징

기능 개발용 ELISA 키트 사전 코팅 ELISA 키트 멀티플렉스 엘리사

읽기

HRP-TMB

HRP-TMB

PE/APC

인큐베이션 시간

2-3시간

2-3시간

2-3시간

감도

pg/ml의

pg/ml의

pg/ml의

유물당 대상 수

1

1

24

계기가 필요합니다

ELISA 플레이트 리더기

ELISA 플레이트 리더기

유량 사이토미터

ELISA에 대한 항체 유형

ELISA 키트는 검출 및 포획 항체를 위해 단일 클론 또는 폴리 클론 항체를 사용하여 만들어집니다. 모노 클론은 단일 에피토프를 인식하는 이점을 제공하므로 특정 항원에 대한 정확한 분석을 제공합니다. 그러나 폴리 클론은 증가 된 양의 항원을 포획하는 이점이 있습니다. 최근 재조합 단일 클론 항체가 ELISA 키트를 만드는 데 사용되어 특이성과 일관성을 증가시킵니다.

ELISA Genie Pharmagenie 키트 제품군은IL-1 베타,IFN-감마, IL-2, IL-4,IL-6등 주요 사이토카인 대상에 고품질 단클론 항체를 사용하여 제조됩니다.CXCL8/IL-8및 더 많은 대상

블로킹 버퍼

> 차단 버퍼 최적화

ELISA 어세이 플레이트에 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위해 차단 버퍼를 사용하여 플레이트를 코팅합니다. ELISA 플레이트의 결합 능력은 플레이트에 코팅된 단백질 (포획 항체/항원) 의 양보다 높습니다. 따라서 후속 배양 단계에서 항체 또는 다른 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위해 나머지 영역을 차단해야합니다. 따라서 차단 버퍼는 후속 단계에서 다른 단백질 또는 검출 항체와 결합되거나 복합체를 형성하지 않는 단백질을 사용하여 사용됩니다. 따라서 블로킹 버퍼는 비특이적 단백질의 결합을 방지하고 배경 잡음을 감소시켜 신호 대 잡음비를 증가시키기 때문에 ELISA 감도를 증가시킵니다.

ELISA 개발 중 여러 가지 블로킹 버퍼를 테스트하여 분석이 최적화되고 신호 대 잡음비를 개선해야 합니다. 단백질의 비특이적 결합에 영향을 줄 수있는 요인은 단백질의 형성이다.단백질 상호 작용. 블록 버퍼를 최적화 할 때 핵심은 신호 대 잡음비의 증가를 최적화하는 것입니다. 이는 표적 분석기와 함께 샘플을 추가하지 않고 제어 우물을 사용하여 발견됩니다.

차단 버퍼를 최적화 할 때 항체 항원 상호 작용을 억제하거나 잠재적으로 효소 활성을 억제하여 신호 대 잡음비를 감소시킬 수있는 과도한 농도의 차단제를 사용하지 않는 것이 중요합니다. 블로킹을 최적화 할 때 최적의 신호를 최적화하기 위해 몇 가지 버퍼를 테스트 할 수 있습니다.

> 코팅 버퍼

ELISA 코팅 버퍼는 마이크로 타이트 플레이트의 단백질/분석물 또는 항체를 고정시키는 데 사용됩니다. 마이크로 타이트 플레이트에 대한 분석/항체의 고정화에 있어 주요 요인은 코팅 버퍼의 pH가 될 수 있습니다. pH 7.4와 pH 9.6 사이의 코팅 버퍼를 선택하면 단백질/항체/분석물 결합의 스테릭 구조에 영향을 주어 고정화에 영향을 줄 수 있습니다. 코팅 버퍼의 테스트는 고정된 항체의 이동성과 성능을 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 하나의 플레이트용 SuperSet 개발 ELISA 키트에서 10ml의 코팅 버퍼에 포착 항체 100µl을 추가합니다.

블로킹 버퍼 레시피

인산염 완충 식염수 (PBS)

1% BSA

코팅 버퍼 레시피 (1L) 재료 금액

Na₂CO₂

1.5g

NaHCO₃

2.93g

증류수

1L (pH 9.6)

엘리사 세척 단계

배양 단계에 따라 배경 신호를 줄이기 위해 결합 된 비특이적 단백질 및 시약을 제거하기 위해 세척 단계가 필요합니다. 각 키트에는 지정된 양의 세척 단계가 필요합니다. 세척 할 때, 세척 단계의 불충분 한 수는 높은 배경을 초래하지만, 반대로, 오버 세척은 ELISA 플레이트에서 항체 및/또는 항원의 제거를 초래하여 감도와 신호를 감소시킬 수있다. 플레이트 와셔를 사용한 자동 세척은 수동으로 세척 단계를 수행하는 것보다 효율적일 수 있습니다.

세척 단계는 TBS (트리스 완충 식염수) 또는 PBS (인산염 완충 식염수) 를 사용하여 수행됩니다. 또한 0.5% Tween-20을 추가하여 비특이적 결합 단백질을 제거 할 수 있습니다.  

ELISA 데이터 분석

ELISA 프로토콜 완료 후 다음 단계는 ELISA 플레이트 리더기를 사용하여 데이터를 획득하고 분석하는 것입니다.

ELISA를 수행 할 때 결과의 통계적 유의성을 보장하기 위해 샘플을 중복 또는 삼중으로 실행하는 것이 좋습니다. 또한, 같은 표준, 알려진 긍정적 인 제어 및 공지 된 항원 또는 샘플과 같은 부정적인 통제와 같은 긍정적 인 통제가 필요할 수 있습니다.

  • 네거티브 컨트롤: 분석기가 없는 샘플
  • 포지티브 컨트롤: 분석물의 존재 또는 양이 알려진 샘플

사용 된 ELISA의 유형에 따라 (정성, 반 정량 또는 양적) 데이터 출력이 달라집니다. 따라서 분석하려는 데이터를 기반으로 사용할 특정 ELISA를 선택합니다. 데이터는 시료의 로그 농도 대 광학 밀도 (OD) 의 플롯으로 표시됩니다. 알려진 농도를 가진 표준은 알 수 없는 분석물의 농도를 결정할 수 있는 표준 곡선을 생성하는 데 사용됩니다.

변동 계수

변동 계수는 결과의 불일치 및 부정확성을 식별하는 데 도움이 됩니다. 이는 평균에 대한 분산의 백분율로 표현됩니다. 분산이 클수록 불일치와 오차가 커집니다. 계수 변동 (CV) 은 표준 편차 σ와 평균 µ의 비율입니다.

Cv= σ/µ

  • 높은 이력서는 다음 중 일부 또는 전부에 기인할 수 있습니다.
  • 파이펫팅 부정확성
  • 박테리아/곰팡이 또는 기타 시약으로 시료 오염
  • 온도 변화- 플레이트는 초안에서 떨어진 안정적인 온도에서 배양되어야합니다.
  • 우물 건조 — 모든 배양 단계에서 플레이트를 덮어야합니다.

Author: Seán Mac Fhearraigh PhD (translated by Dohee Kim)