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Astuces optimisation ELISA

Astuces optimisation ELISA

Our 8 tips below help you optimise your ELISA protocol to get the results you need. Check out our resources page for further advice on ELISA assay protocols.

Quelques astuces pour optimiser votre test ELISA

Vous trouverez ci-dessous quelques astuces pour optimiser chaque étape de votre test ELISA. Ces astuces vous aideront à maintenir cohérence et standardisation, des éléments essentiels pour un test reproductible et précis.

Outre l’optimisation de vos tests ELISA suivant les astuces décrites ci-dessous, il est également crucial que toutes les pipettes utilisées au cours de vos tests soient régulièrement calibrées, et que vous utilisiez des pipettes multi-canaux aussi souvent que possible afin de minimiser les variations techniques.

Pour chaque étape décrite ci-dessous, choisir la condition donnant le meilleur rapport signal/bruit de fond : un signal fort pour un bruit de fond faible.

1. Optimisation de la concentration de l’anticorps de capture

Préparer différentes concentrations de l’anticorps de capture dans du tampon de revêtement (“coating buffer”) et passer à l’étape de détection.

2. Optimisation du tampon de saturation

Préparer différentes solutions de tampon de saturation. Déposer un volume identique de chaque solution dans chaque puits.

3. Optimisation du diluant du standard

Il est important d’adapter le diluant du standard utilisé à la matrice des échantillons. Un diluant optimal aura une gamme dynamique adéquate pour établir la courbe standard et une linéarité de dilution pour les échantillons. Si la courbe standard générée a une gamme dynamique inappropriée, il peut s’avérer nécessaire de choisir un diluant différent. Si l’échantillon a une linéarité inadéquate après dilution dans le diluant, il peut y avoir un déséquilibre entre la matrice de l’échantillon et le diluant du standard, auquel cas un test de titration (“spiking recovery”) devrait être réalisé.

4. Optimisation de la concentration des échantillons

Préparer différentes concentrations des échantillons dans le diluant du standard. Prendre soin de tester une large gamme de concentrations des échantillons. Noter la limite de détection du substrat utilisé. Prendre soin de vérifier que la matrice de l’échantillon biologique ne masque pas ou n’accroît pas le signal en réalisant des tests de titration (“spiking recovery”) et de linéarité.

5. Optimisation de la concentration de l’anticorps de détection

Préparer différentes concentrations de l’anticorps de détection pour les tester.

6. Optimisation du conjugué enzymatique

Préparer différentes concentrations du conjugué enzymatique dans le diluant du standard. S’assurer que la concentration reste dans la gamme décrite pour le substrat.

7. Optimisation de la détection du signal

Le substrat utilisé est approprié si l’antigène peut être détecté au sein d’une gamme dynamique précédemment établie.

8. Optimisation de l’effet matrice

L’effet matrice concerne les échantillons de plasma ou de sérum. Différents éléments de ces échantillons biologiques peuvent causer des interférences, dont des interactions cross-réactives et non-spécifiques avec des substances de la matrice ou une dégradation de produits biologiques durant la manipulation des échantillons. L’effet matrice peut être réduit par la dilution des échantillons.

9. Optimisation des étapes de lavage

Durant les étapes de lavage d’une plaque ELISA, s’assurer de remplir les puits avec un volume approprié de tampon de lavage pour éliminer les complexes non-spécifiques.

Concentrations recommandées * pour les anticorps de capture et de détection :

(* Ces valeurs sont seulement des recommandations, des optimisations peuvent être nécessaires.)

Source Anticorps de capture 5-15 µg/ml

Sérum polyclonal

5-15 µg/ml

1-10 µg/ml

Anticorps monoclonal purifié

1-12 µg/ml

0.5-5 µg/ml

Anticorps polyclonal purifié

1-12 µg/ml

0.5-5 µg/ml

Concentrations recommandées* pour l’anticorps secondaire :

(* Ces valeurs sont seulement des recommandations, des optimisations peuvent être nécessaires.)

Enzyme Système de détection Concentrations recommandées

HRP

Chimifluorescent

25-50 ng/ml

Chimifluorescent

10-100 ng/ml

Colorimétrique

20-200 ng/ml

Alkaline Phosphatase

Chimifluorescent

40-200 ng/ml

Colorimétrique

100-200 ng/ml