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101 Tipps zur Fehlerbehebung bei ELISA

Unsere Anleitung mit 101 Tipps zur Fehlerbehebung bei ELISA wurde dazu entworfen, dir bei den üblichen Problemen, die Wissenschaftler bei der Durchführung von Proben mit ELISA-Kits haben, zu helfen. Dein ELISA-Verfahren zu optimieren und die typischen Fehler zu vermeiden kann deine Ergebnisse dramatisch verbessern und die Sensibilität der Tests steigern. In dieser Anleitung zur Fehlerbehebung bei ELISA haben wir die Bereiche aufgelistet, in denen Wissenschaftler häufig Problemen begegnen.

Die wichtigsten Bereiche zur Fehlerbehebung bei ELISA:

Hohe Signalstärke:

Eine hohe Signalstärke kann aus mehreren Gründen entstehen: Unzureichendes Waschen der Platte, zu spätes Stoppen der Reaktion und Verwendung von zu viel analytischem Reagenzstoff. Wenn du eine zu hohe Signalstärke erhältst kann dies in vielen falsch-positiven und inkorrekten Daten resultieren.

Daten außerhalb des Bereichs:

Dies kann durch deine Proben, unzureichendes Waschen oder inkorrekte Verdünnungen entstehen. Es resultiert in einem Datenverlust, da negative oder keine Ergebnisse erhalten werden.

Starke Abweichungen der Daten:

Große Schwankungen entstehen durch Fehler in der Probenvorbereitung, Pipettierfehler, unzureichende Agitation der Platten, etc. Daten mit großen Schwankungen können die echten Resultate verzerren und widersprüchliche Ergebnisse hervorrufen.

Starke Hintergrundsignale:

Hintergrundsignale können auftreten, wenn ein unangemessener Waschprozess angewandt wurde oder Kreuzreaktionen und Kontaminationen aufgetreten sind. Diese Hintergrundsignale können ebenfalls zu falsch-positiven/falsch-negativen Resultaten führen und die Ergebnisse beeinträchtigen.

Kein Signal:

Verschiedene Probleme bezüglich der Proben und des Assays können dazu führen, dass dein ELISA-Test kein Signal zeigt. Azid im Waschpuffer, eine zu niedrige Detektionsschwelle oder das Fehlen von Avidin-HRP können ein Teil dieser Probleme sein. Kein Signal bedeutet, dass deine wertvollen Proben keine Ergebnisse liefern. Lies dir die unten aufgelisteten Gründe durch, um dies zu vermeiden.

Falsche Standardkurve:

Wenn die Standardkurve nicht korrekt angefertigt wurde, kann sie unpublizierbare Ergebnisse verursachen. Wenn die Reagenzien nicht richtig vermischt wurden, die Standardprobe degradiert ist, oder Pipettierfehler aufgetreten sind, kann eine falsche Standardkurve entstehen.

ELISA Fehlerbehebung für eine hohe Signalstärke 

  1. Die TMB-Substratlösung war kontaminiert:

    Verwende eine frische TMB-Substratlösung, welche klar und farblos sein sollte bevor du sie in die Wells gibst. Stelle sicher, dass die V-Boden-Behälter sauber sind, bevor du die Substratlösung in die Wells pipettierst.
  2. Reaktion nicht gestoppt:

    Die Farbe wird sich weiterentwickeln, wenn die Reaktion nicht gestoppt wurde.

  3. Die Platte wurde zu lange beiseite gestellt, bis sie auf dem Plattenleser analysiert wurde:

    Die Farbe wird sich weiterentwickeln (jedoch langsamer, wenn die Stopplösung hinzugefügt wurde.)

  4. Kontamination des Laborglasgeschirrs:

    Stelle sicher, dass die Reagenzien frisch sind und in sauberem Glasgeschirr vorbereitet wurden.

  5. Substratinkubation wurde im Hellen durchgeführt:

    Substratinkubation sollte im Dunkeln stattfinden. Stelle sicher, dass das Substrat keiner Lichteinstrahlung ausgesetzt wird – bewahre es also an einem dunklen Ort auf. Limitiere die Lichteinstrahlung auch während des Assays.

  6. Die Wells wurden unzureichend gewaschen:

    Wasche die Wells und beachte die Empfehlungen im Protokoll.

  7. Es wurde zu viel Nachweisreagenz hinzugefügt:

    Sorge dafür, dass das Nachweisreagenz korrekt verdünnt wird oder verringere die empfohlene Konzentration.

  8. Der Blockierungspuffer wirkt nicht (z.B. Nachweisreagenz bindet an den Blocker; Wells sind nicht komplett blockiert):

    Versuche es mit einem anderen Blockierungsreagenten und/oder füge das Blockierungsreagenz zum Waschpuffer hinzu.

  9. Salzkonzentration des Inkubations-/Waschpuffers:

    Erhöhte Salzkonzentrationen können non-spezifische und/oder schwache unerwünschte Interaktionen reduzieren.

  10. Hohe Antikörper-Konzentration:

    Probiere für optimale Ergebnisse verschiedene Verdünnungen aus.

  11. Nach dem Einfüllen des Substrats bilden sich Präzipitate in den Wells:

    Erhöhe den Verdünnungsfaktor der Probe oder reduziere die Konzentration des Substrats.

  12. Schmutzige Platte:

    Reinige den Boden der Platte.

  13. Es wurden inkorrekte Verdünnungen beim Anfertigen der Standardkurve vorbereitet:

    Verbessere deine Pipettiertechnik. Eine Kalibrierung der Pipetten ist eventuell nötig.

  14. Längere Inkubationszeiten als empfohlen:

    Stelle sicher, dass deine Inkubationszeiten korrekt sind und halte dich an das Protokoll, das der technischen Bedienungsanleitung beiliegt.

  15. Plattenversiegelungen oder Reagenzbehälter wurden wiederverwendet, was zu HRP-Rückständen führt. Dies führt dazu, dass sich das TMB unspezifisch blau färbt:

    Die
    Wiederverwendung von Plattenversiegelungen können zu einem Auftreten von HRP-Rückständen führen, welches zu einer starken blauen Färbung führt. Verwende neue Plattenversiegelungen und Reagenzbehälter, um dies zu vermeiden.

  16. Kontamination der Puffer:

    Bereite immer frische Puffer vor.

 ELISA Fehlerbehebung für Daten, die außerhalb des Bereiches liegen 

  1. Die Proben enthalten keine oder nicht-detektierbare Mengen des Analyten:

    Wenn die Proben unter dem detektierbaren Spiegel liegen, kann es funktionieren, ein größeres Volumen zu untersuchen. Kläre mögliche Protokollmodifikationen mit dem technischen Support ab.

  2. Proben enthalten Analytkonzentrationen, die höher sind als der höchste Standardpunkt:

    Die Proben müssen eventuell weiter verdünnt werden.

  3. Unzureichendes Waschen:

    Verwende einen angemessenen Waschvorgang – Siehe unten. Nach jedem Waschvorgang sollte die Platte umgekehrt auf ein saugfähiges Tuch gelegt werden um komplett zu trocknen. Schlage die Schale wenn nötig auf den Tisch, um Flüssigkeitsrückstände zu entfernen.

  4. Plattenversiegelungen wurden nicht benutzt oder wiederverwendet:

    Verdecke die Platten während der Inkubationszeit mit Plattenversiegelungen. Verwende jedes mal, wenn die Platte geöffnet wurde eine neue Versiegelung. Dies hält die Wells davon ab, sich gegenseitig zu kontaminieren.

  5. Inkorrekte Verdünnungen:

    Überprüfe deine Pipettiertechnik – siehe unten – und deine Berechnungen.

  6. Längere Inkubationszeit als empfohlen:

    Gefertigte Kits besitzen optimierte Protokolle. Folge diesem Protokoll und halte dich an die Inkubationszeiten.Wenn du ein ELISA-Assay mit Antikörper-Pärchen durchführst, sollte das Protokoll angepasst werden. Sieh dir dafür ELISA Entwicklung und Optimierung an.

  7. Die Substratlösung wurde zu früh prepariert und färbte sich blau:

    Substratlösungen sollten gemischt und dann sofort verwendet werden.

  8. Zu viel Streptavidin-HRP:

    Überprüfe die Verdünnung und titriere wenn nötig.

  9. Plattenversiegelungen oder Reagenzbehälter wurden wiederverwendet, wodurch HRP-Reste verbleiben:

    Benutze für jeden Schritt eine neue Plattenversiegelung und einen neuen Reagenzbehälter.

  10. Puffer kontaminiert mit Metallen oder HRP:

    Setze frische Puffer an.

 ELISA Fehlerbehebung für starke Abweichung der Daten 

  1. Fehler von Mehrkanalpipetten:

    Kalibriere die Pipetten.

  2. Das Waschen der Platten war nich angemessen oder ungleichmäßig:

    Stelle sicher, dass die Pipettenspitzen fest sitzen und dass alle Reagenzien im Waschvorgang komplett entfernt wurden.

  3. Nicht-homogene Proben:

    Mische die Proben vor dem Pipettieren gründlich.

  4. Proben können eine hohe Partikelmasse enthalten:

    Entferne die Partikelmasse durch Zentrifugation.

  5. Unzureichende Agitation der Platten:

    Die Platte sollte während allen Inkubationsschritten von einem ELISA-Plattenschüttler mit einer bestimmten Geschwindigkeit bewegt werden, sodass die Probe in konstanter Bewegung bleibt, aber nicht aus der Well spritzt.

  6. Well-Kreuzkontamination:

    Wenn du Plattenversiegelungen wiederverwendest, solltest du darauf achten, dass kein Reagenz die Versiegelung berührt hat. Bei Verwendung der selben Pipettenspitzen zum Hinzufügen von Reagenzien sollte man vorsichtig sein. Sorge dafür, dass die Pipettenspitzen die Reagenzien in der Platte nicht berühren.

  7. Stapeln der Platten während der Inkubationszeit:

    Durch das Stapeln der Platten wird eine gleichmäßige Wärmeverteilung nicht gewährleistet. Vermeide das Stapeln von Platten.

  8. Inkonsistente Pipetten:

    Stelle sicher, dass die Pipetten richtig funktionieren und kalibriert sind. Die Spitzen sollten weit genug aufgedrückt werden, sodass sie dicht sind. Sei besonders vorsichtig, wenn du die Platte verdünnst und beobachte, ob alle Pipettenspitzen die richtige Menge Flüssigkeit aufnehmen und abgeben.

  9. Antikörper-Verdünnungen/Reagenzien sind nicht gut gemischt:

    Um eine gleichmäßige Konzentration in allen Wells zu erhalten sollten die Reagenzien und Proben vor dem Pipettieren gemischt werden.

  10. Die Wells sind ausgetrocknet:

    Sorge dafür, dass sich beim Inkubieren die Deckel auf den Schalen befinden. Platziere einen Wasserbehälter unter die Platten, der für höhere Luftfeuchtigkeit sorgt.

  11. Der Boden der Platte ist dreckig:

    Reinige den Boden der Platte vorsichtig, bevor du sie erneut scannst.

  12. Blasen in den Wells:

    Stelle sicher, dass sich vor dem Lesen der Platten keine Blasen in den Wells befinden.

  13. Kanteneffekt:

    Stelle sicher, dass sich alle Platten und Reagenzien bei Raumtemperatur befinden.

  14. Lagerung:

    Die Reagenzien und Proben sollten bei Raumtemperatur gelagert werden.

  15. Fängerantikörper hat nicht an die Platte gebunden:

    Stelle sicher, dass du eine ELISA-Platte anstatt einer Gewebekulturschale verwendest. Verdünne die Antikörper in PBS. Achte auf eine korrekte Vorbereitung und Inkubationszeit bezüglich der Beschichtungs- und Blockierschritte.

  16. Abweichungen im Protokoll:

    Halte dich an das Protokoll, das dem Assay beiliegt.

  17. Inkorrekte Berechnungen für die Standardkurve:

    Überprüfe die Berechnungen, lege eine neue Standardkurve an, und verwende interne Kontrollen.

  18. Kontaminierte Puffer:

    Verwende frische Puffer.

  19. Well-Boden ist zerkratzt: 

    Vermeide beim Pipettieren Kontakt mit dem Boden. Halte die Pipette an die Seite der Well, um den Boden nicht zu beschädigen.

 ELISA Fehlerbehebung für starke Hintergrundsignale 

  1. Angrenzende Wells waren kontaminiert:

    Vermeide Kontaminationen zwischen Wells durch korrekte Verwendung der Plattenversiegelungen. Verwende Multikanalpipetten, ohne die Reagenzien auf der Platte zu berühren.

  2. Die verwendete Matrix enthält endogene Analyten oder Stoffe, die die Reaktion beeinträchtigen:

    Überprüfe die Inhaltsstoffe der Matrix auf störende Stoffe (z.B. Interleukin-modifiziertes Gewebekulturmedium).

  3. Unzureichendes Waschen:

    Erhöhe die Anzahl der Waschvorgänge. Verlängere die Zeit zum Einziehen zwischen den Waschvorgängen, bevor du Substratlösung einfüllst.

  4. Kreuzreaktivität:

    Die nachzuweisenden Antikörper reagieren mit den Fängerantikörpern. Führe angemessene Kontrollen durch.

  5. Unspezifische Bindung von Antikörpern:

    Stelle sicher, dass ein Blockierungsschritt mit angemessenem Blockierungspuffer vorliegt. Wir empfehlen, 5 oder 10% Serum der selben Spezies, von der der sekundäre Antikörper stammt, oder Rinderserum zu verwenden.

  6. Die Konzentration des konjugierten sekundären Antikörpers ist zu hoch:

    Verdünne die Lösung, um die optimale Konzentration herauszufinden.

  7. Inkorrekte Assay-Temperatur:

    Die Inkubationstemperatur sollte 37°C nicht überschreiten.

  8. Unangemessenes Waschen:

    Stelle sicher, dass die Wells mit Waschpuffer gefüllt wurden und danach komplett leer sind. Verwende einen automatisierten Platten-Washer, wenn dieser vorhanden ist. Erhöhe die Anzahl der Waschvorgänge. Führe einen 30-sekündigen Schritt zum Einziehen zwischen den Waschvorgängen durch.

  9. Kontaminierende Enzyme sind in der Probe vorhanden:

    Teste nur die Probe mit dem Substrat, um kontaminierende Enzymaktivität festzustellen.

  10. Die Wells sind unzureichend gewaschen:

    Wasche die Wells nach den Empfehlungen des Protokolls.

  11. Kontaminierter Waschpuffer:

    Setze frische Puffer an.

  12. Zu viel Detektionsreagenz:

    Stelle sicher, dass das Detektionsreagenz richtig verdünnt wurde oder reduziere die empfohlene Konzentration des Detektionsreagenz.

  13. Blockierungspuffer ist nicht wirksam:

    Verwende einen anderen Blockierungspuffer und/oder gib das Blockierungsreagenz zum Waschpuffer hinzu.

  14. Salzkonzentration des Inkubations-/Waschpuffers:

    Erhöhte Salzkonzentrationen können unspezifische und/oder schwache Wechselwirkungen verhindern.

  15. Zu langes Warten zwischen Hinzufügen der Stop-Lösung und dem Lesen der Platte:

    Die Platte sollte sofort nach dem Hinzufügen der Stop-Lösung gelesen werden.

  16. Hohe Antikörper-Konzentration:

    Probiere verschiedene Verdünnungen aus, um die optimalen Ergebnisse zu erzielen.

  17. Substratinkubation wurde im Hellen durchgeführt:

    Substratinkubation sollte im Dunkeln stattfinden. Stelle sicher, dass das Substrat keiner Lichteinstrahlung ausgesetzt wird.

  18. Nach Hinzugeben des Substrats entstehen Präzipitate in den Wells:

    Erhöhe den Verdünnungsfaktor der Probe oder verringere die Konzentration des Substrats.

  19. Dreckige Platte:

    Reinige den Boden der Platte mit einem Tuch.

 ELISA-Fehlerbehebung für den Fall, dass kein Signal entsteht 

  1. Es wurden inkorrekte oder keine Detektionsantikörper hinzugegeben:

    Gib einen angemessenen Detektionsantikörper hinzu und fahre fort.

  2. Avidin-HRP wurde nicht hinzugefügt:

    Gib Avidin-HRP nach Anleitung des Protokolls hinzu.

  3. Es wurde keine Substratlösung hinzugegeben:

    Verwende eine angemessene Substratlösung und fahre fort.

  4. Der Waschpuffer enthält Azid:

    Vermeide Natiumazid im Waschpuffer.

  5. Zu kurze Inkubationszeit:

    Inkubiere die Proben bei 4°C über Nacht oder befolge die Richtlinien des Herstellers.

  6. Die Konzentration des Zielmoleküls liegt unter der Detektionsschwelle:

    Reduziere den Verdünnungsfaktor oder konzentriere die Proben.

  7. Inkompatibler Probentyp:

    Die Detektion kann verringert oder nicht vorhanden sein, wenn diese Art von Probe noch nicht getestet wurde. Verwende eine Probe, von der du weißt, dass die positive Kontrolle erkannt wird.

  8. Erkennung des Epitops ist aufgrund der Platte nicht möglich:

    Reagiere das Peptid mit einem größeren Trägerprotein, um die Erkennung des Peptids durch ein direktes oder indirektes ELISA-Assay zu verbessern.

  9. Assay-Puffer Inkompatibilität:

    Stelle sicher, dass der Puffer mit dem nachzuweisenden Molekül kompatibel ist (z.B. ob die Enzymaktivität und Proteininteraktionen bleiben).

  10. Nicht genug Detektionsreagenz:

    Erhöhre nach Anleitung des Herstellers die Konzentration des Detektionsreagenz.

  11. Probe wurde inkorrekt vorbereitet:

    Sorge für eine korrekte Probenvorbereitung und Verdünnung. Proben können inkompatibel mit der Microassay-Platte sein.

  12. Nicht genügend Antikörper:

    Probiere verschiedene Konzentrationen und Verdünnungen aus.

  13. Temperatur während der Inkubation zu niedrig:

    Stelle sicher, dass die Inkubationen bei der richtigen Temperatur stattfinden. Alle Reagenzien und die Platte sollten sich entweder bei Raumtemperatur oder bei der Temperatur, die vom Hersteller angegeben wird befinden.

  14. Inkorrekte Wellenlänge:

    Verifiziere die Wellenlänge und lies die Platten erneut.

  15. Platten wurden zu kräftig gewaschen:

    Überprüfe, ob der Druck im automatischen Platten-Washer richtig eingestellt ist. Pipettiere den Waschpuffer vorsichtig, wenn du die Platten manuell wäschst.

  16. Die Wells sind ausgetocknet:

    Lasse die Wells nicht austrocknen, sobald du mit dem Assay angefangen hast. Versiegele die Platten vor jeder Inkubation.

  17. Langsame Entwicklung der Farben durch enzymatische Reaktion:

    Bereite die Substratlösung direkt vor dem Assay vor. Stelle sicher, dass die Stammlösung weder abgelaufen, noch kontaminiert ist. Verlängere die Inkubationszeit.

  18. Ungleichmäßige Farbe:

    Stelle sicher, dass alle Wells korrekt gewaschen wurden. Verwende wenn möglich einen ELISA-Platten-Washer.

  19. Reagenzien nicht bei Raumtemperatur:

    Am Anfang des Assays sollten sich alle Reagenzien bei Raumtemperatur befinden. Diese sollte nach 15-20 Minuten auf dem Labortisch erreicht sein.

  20. Abgelaufene Reagenzien:

    Stelle sicher, dass kein Reagenz abgelaufen ist.

  21. Format des Assays nicht sensibel genug:

    Verwende ein empfindlicheres Format (z.B. Sandwich ELISA statt direktes ELISA). Verlängere die Inkubationszeit oder erhöhe die Temperatur. Außerdem kann die Detektionsart geändert werden.

  22. Es wurde Puffer mit FCS verwendet, um die Antikörper zu rekonstituieren:

    Bewerte die verwendeten Reagenzien neu.

 ELISA Fehlerbehebung für eine falsche Standardkurve 

  1. Standard wurde inkorrekt rekonstituiert oder falsch gelagert:

    Rekonstituiere den Standard nach Protokoll und befolge die Anleitungen zur Lagerung.

  2. Reagenzien wurden in falscher Konzentration in die Wells gegeben:

    Überprüfe die Pipetten und korrigiere das Volumen der Reagenzien.

  3. Inkubation wurde bei einer falschen Temperatur durchgeführt:

    Folge zur Lagerung, Inkubation, und Agitation dem Protokoll.

  4. Rückstände in den Wells:

    Nimm zwischen den verschiedenen Schritten die gesamte Flüssigkeit auf und wasche die Platten immer, wenn nötig.

  5. Platten wurden während der Inkubation gestapelt:

    Stelle die Platten nebeneinander.

  6. Falsche Verdünnungsreihe:

    Überprüfe die Verdünnungsschritte, die im Protokoll stehen.

  7. Reagenzien schlecht gemischt:

    Vermische alle Reagenzien sorgsam, bevor du mit dem Assay anfängst.

  8. Schlechte oder verschieden starke Adsorption der Reagenzien:

    Überprüfe die Wahl des Beschichtungspuffers. Dieser ist normalerweise PBS mit einem pH-Wert von 7,4 oder Bikarbonat mit einem pH-Wert von 9,6. Versuche, die Inkubationszeit zu verlängern oder andere Platten zu verwenden.

  9. Standard ist degradiert:

    Stelle sicher, dass der Standard korrekt gelagert wurde.

  10. Die Kurve passt nicht zum Maßstab:

    Versuche, die Kurve mit verschiedenen Maßstäben (z.B log-log, 5PL) anzulegen.

  11. Pipettierfehler:

    Überprüfe die Pipetten und kalibriere sie.

  12. Fängerantikörper bindet nicht an die Platte:

    Stelle sicher, dass du eine ELISA-Platte anstatt einer Gewebekultur-Platte verwendest.

  13. Nicht genug Detektionsantikörper:

    Überprüfe die Verdünnung und titriere wenn nötig.

  14. Inkorrekte Berechnung der Verdünnung für die Standardkurve:

    Überprüfe die Berechnungen und lege eine neue Kurve an.

  15. Verwendung von Reagenzien aus verschiedenen Kits:

    Vermeide dies, da es die Qualität deines Assays beeinflussen kann.