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101 sugerencias para solucionar problemas de ELISA

101 sugerencias para solucionar problemas de ELISA

101 sugerencias para solucionar problemas de ELISA

Nuestra guía de 101 sugerencias para solucionar problemas de ELISA está diseñada para ayudarle a mejorar y resolver los problemas más comunes a los que se enfrentan los investigadores con sus equipos de ELISA al realizar ensayos. Optimizar su ELISA y eliminar los errores más comunes que se puedan cometer puede mejorar sus resultados y la sensibilidad de sus ensayos ELISA dramáticamente. En esta guía de resolución de problemas de ELISA hemos detallado las áreas comunes en las cuales los investigadores encuentran problemas con su ELISA.

Áreas clave de resolución de problemas de ELISA:

Señal alta:

Una señal alta puede ocurrir por numerosas razones, incluyendo un lavado insuficiente de la placa, no detener la reacción y añadir demasiado reactivo de detección. Si obtiene una señal alta, esto tiene como resultado muchos falsos positivos y datos incorrectos.

Fuera de rango:

A veces esto puede suceder en base a sus muestras, a un lavado insuficiente o a una preparación incorrecta de las diluciones. Esto puede ocasionar una pérdida de datos debido a la falta de resultados o resultados negativos.

Variación alta:

Una variación alta se puede beber a errores en la preparación de la muestra, inconsistencias y errores en la pipeta, agitación insuficiente de la placa, entre otros problemas. Los datos con variación alta puede afectar los resultados reales y causar inconsistencias en los datos.

El fondo es alto

Un fondo alto puede resultar a partir de pasos incorrectos de lavado, reactividad cruzada de las muestras o contaminación. Nuevamente, un fondo alto puede resultar en datos negativos o falsos positivos y afectar sus resultados.

Falta de señal:

La falta de señal en su ensayo Elisa puede ser el resultado de numerosos problemas con la muestra y el ensayo incluyendo que la solución de lavado contenga azida, que el objetivo esté por debajo de la detección del ensayo, o que no se haya agregado avidin-HRP. Una falta de señal puede significar que no haya resultados de muestras valiosas, así que le recomendamos leer las razones mencionadas debajo para evitar estos problemas.

Curva estándar pobre

Una curva estándar pobre mostrará resultados imposibles de ser publicados si no se prepara correctamente. Las razones pueden ser una mezcla pobre de los reactivos, que el estándar se haya degradado, o que haya habido errores de pipeta.

Resolución de problemas de ELISA para señal alta

1. La solución de sustrato TMB fue contaminada Use solución de sustrato TMB fresca, la cual debería ser transparente e incolora antes de su agregado a los pocillos. Utilice un contenedor transparente de fondo en V antes transferir la solución de sustrato en pipeta a los pocillos.
2. Reacción no detenida El color seguirá desarrollándose si la reacción de sustrato no se detiene.
3. La placa se ha dejado demasiado tiempo antes de poder leer el lector de la placa El color seguirá desarrollándose (aunque a una velocidad menor si se ha agregado una solución de detención)
4. Contaminantes de los utensilios de vidrio de laboratorio Asegúrese de que los reactivos estén frescos y preparados en recipientes limpios de vidrio
5. Incubación del sustrato realizada a la luz La incubación del sustrato debe realizarse en la oscuridad. Asegúrese de que el sustrato no esté expuesto a la luz y guárdelo en un lugar oscuro. Limite la exposición a la luz mientras realiza el ensayo.
6. Los pocillos se han lavado insuficientemente Lave los pocillos en base a las recomendaciones del protocolo.
7. Se ha añadido demasiado reactivo de detección Asegúrese de que el reactivo se haya diluido apropiadamente o reduzca la concentración recomendada del reactivo de detección.
8. Solución bloqueante inefectiva (por ejemplo, el reactivo de detección se une al bloqueador; pocillos no completamente bloqueados) Pruebe un reactivo de bloqueo diferente y agregue un reactivo de bloqueo a la solución de lavado.
9. Concentración de sal de las soluciones de lavado/incubación El aumento de las concentraciones de sal puede reducir interacciones no acertadas débiles y/o no específicas.
10. Alta concentración de anticuerpos Pruebe distintas soluciones para óptimos resultados.
11. Se forma precipitado en los pocillos luego de la adición de sustrato Disminuya el factor de dilución de la muestra o disminuya la concentración del sustrato.
12. Placa sucia Limpie el fondo de la placa
13. Preparación de diluciones de curva estándar incorrectas Verifique su técnica de uso de pipeta. Puede requerir una calibración de las pipetas.
14. Tiempos de incubación más largos que lo recomendado Asegúrese de que los tiempos de incubación sean correctos y siga el protocolo provisto con el manual técnico
15. Las tapas para placas o los depósitos de reactivos se reúsan, resultando en la presencia de HRP residual. Esto volverá la TMB azul no específicamente Reusar las tapas de las placas puede causar la presencia de HRP residual, provocando un cambio de color no específico de TMB. Para evitar esto, use tapas frescas para las placas y un depósito de reactivo para cada paso
16. Contaminación de las soluciones Siempre cree soluciones frescas

Solución de problemas de ELISA para

Fuera de rango

17. Las muestras contienen ningún nivel de analito o está por debajo de lo detectable Si las muestras están por debajo de los niveles detectables, puede ser posible usar un volumen alto de muestras. Verifique con soporte técnico las modificaciones del protocolo adecuadas.
18. Las muestras contienen concentraciones de analito más altas que el punto más alto de referencia Las muestras pueden requerir mayor dilución
19. Lavado insuficiente Use el procedimiento de lavado apropiado mencionado debajo. Al final de cada paso de lavado, invierta la placa sobre papel absorbente y déjela que se escurra completamente repasándola con el papel con fuerza si es necesario para remover cualquier residuo de fluidos.
20. Las tapas de las placas no se usan ni reúsan Durante las incubaciones, cubra las placas de los ensayos con tapas para placas. O sea una tapa fresca cada vez que se abra la placa. Esto evitará que los pocillos se contaminen unos a otros.
21. Preparación de diluciones incorrecta Verifique la técnica de uso de pipeta vea debajo y verifica doblemente los cálculos.
22. Tiempos de incubación más largos que lo recomendado Los equipos manufacturados tienen protocolos optimizados. Asegúrese de seguir los tiempos de incubación recomendados. Si está desarrollando ELISA usando pares de anticuerpos, puede que necesite optimizar el ensayo. Vea Desarrollo y Optimización de ELISA para más información.
23. La solución de sustrato se ha mezclado demasiado temprano y se volvió azul La solución de sustrato debe ser mezclada y usada inmediatamente
24. demasiada estreptavidina-HRP Verifique la dilución, valore si es necesario
25. Las tapas para placas o los depósitos de reactivos se reúsan, resultando en la presencia de HRP residual. Esto volverá la TMB azul no específicamente Use tapas frescas para las placas y un depósito de reactivo para cada paso
26. Soluciones contaminadas con metales o HRP Cree soluciones frescas

Solución de problemas de ELISA para

Variación alta

27. Errores de pipeta multicanal Calibre las pipetas
28. El lavado de la placa no fue adecuado o uniforme Asegúrese de que las puntas de las pipetas estén bien aseguradas. Confirme que todos los reactivos se hayan removido completamente en todos los pasos de lavado
29. Muestras no homogéneas Mezcle las muestras completamente antes de usar la pipeta
30. Las muestras pueden tener una materia particular alta Remueva la materia particular por centrifugación
31. Agitación insuficiente de la placa La placa debe agitarse durante todos los pasos de incubación usando un sacudidor de placas ELISA a la velocidad en la que las soluciones de los pocillos están en movimiento constante sin salpicar
32. Contaminación cruzada Al rehusar las tapas de las placas verifique que ningún reactivo haya tocado la tapa. Se deberá tener cuidado al usar las mismas puntas de las pipetas usadas para añadir reactivos. Asegúrese de que las puntas de las pipetas no toquen los reactivos sobre la placa.
33. Placas apiladas durante las incubaciones Apilar las placas no permite una distribución pareja de la temperatura a través de los pocillos de las placas. Evite apilar.
34. Pipeta inconsistente. Asegúrese de que las pipetas están funcionando correctamente y están calibradas. Asegúrese de que las puntas de las pipetas están siendo presionadas lo más posible para sellarlas bien. Tenga cuidado especial al diluir la placa y observe para asegurarse de que las puntas de las pipetas estén recogiendo y liberando la cantidad correcta de líquido.
35. Los reactivos/diluciones de anticuerpos no están bien mezclados Para asegurar una concentración consistente en todos los pocillos, asegúrese de que todos los reactivos y muestras estén mezclados antes de transferirlos con pipetas sobre las placas.
36. Permitir que el pocillo se seque Asegúrese de que las tapas estén sobre las placas en todo momento al incubar. Coloque una bandeja con agua humidificadora (agua estéril/limpia embotellada) en el fondo de la incubadora.
37. El fondo de la placa está sucio Limpie el fondo de la placa cuidadosamente antes de volver a leer las placas
38. Burbujas en los pocillos Asegúrese de que no haya burbujas antes de leer la placa
39. Efectos de borde Asegúrese de que la placa y todos los reactivos están a temperatura ambiente
40. Almacenamiento Asegure que los reactivos y las muestras estén almacenados a la temperatura correcta
41. El anticuerpo en captura no se pegó a la placa Asegúrese de estar usando una placa para ELISA, no una placa de cultivo de tejidos. Diluya anticuerpos en PBS. Asegure la preparación correcta y el tiempo de incubación tanto para los pasos de recubrimiento como de bloqueo.
42. Variaciones de protocolos Siga el protocolo que viene con su ensayo
43. Cálculos inapropiados de la curva estándar Verifique los cálculos, haga nuevas curvas standard y use controles internos
44. Soluciones contaminadas Use soluciones frescas
45. Fondo descartado del pocillo Evite el contacto con el fondo del pocillo durante el uso de pipetas. Apunte la punta de la pipeta a un lado del pocillo para evitar alterar el fondo

Solución de problemas de ELISA para

El fondo es alto

46. Los fondos de los pocillos están contaminados Evite la contaminación cruzada al usar las tapas apropiadamente. Use pipetas multicanal sin tocar los reactivos sobre la placa.
47. La matriz usada tiene analitos endógenos o interferencia Verifique los ingredientes de la matriz por componentes reactivos cruzados (por ejemplo un medio de cultivo de tejidos modificado de interleucina).
48. Lavados insuficientes Aumente la cantidad de lavados. Aumente el tiempo de remojo entre los lavados antes de añadir la solución de sustrato.
49. Reactividad cruzada Detección del anticuerpo de reacción cruzada con un anticuerpo de recubrimiento. Realice los controles apropiados.
50. Unión no especifica de anticuerpos Asegúrese de que se incluya un paso de bloqueo y que se use una solución de bloqueo apropiada. Recomendamos usar un suero de 5 a 10% de la misma especie de anticuerpo secundario, o suero bovino. Asegúrese de que los pocillos estén preprocesados para prevenir una adherencia no específica. Use un anticuerpo purificado por afinidad, preferentemente preabsorbido
51.. La concentración del anticuerpo secundario conjugado es demasiado alta Realice diluciones para determinar la concentración de funcionamiento óptimo.
52.. Temperatura incorrecta del ensayo Verifique que la temperatura de incubación no sobrepase los 37ºC
53. Lavado inadecuado Asegúrese de que todos los pocillos se llenen con solución de lavado y que se aspiren completamente. Usar un lavador de placas automático si está disponible. Aumente la cantidad de lavados. Agregue un paso de remojo de 30 segundos en medio de los lavados.
54. Enzimas contaminantes presentes en la muestra Pruebe solamente la muestra con sustrato para verificar la actividad de las enzimas contaminantes.
55. Los pocillos se han lavado insuficientemente Lave los pocillos en base a las recomendaciones del protocolo.
56. Contaminación de la solución de lavado Prepare soluciones frescas
57. Demasiado reactivo de detección Asegúrese de que el reactivo se haya diluido apropiadamente o reduzca la concentración recomendada del reactivo de detección.
58. La solución de bloqueo es inefectiva Pruebe una solución reactiva de bloqueo diferente y agregue un reactivo de bloqueo a la solución de lavado.
59. Concentración de sal de las soluciones de lavado/incubación El aumento de las concentraciones de sal puede reducir interacciones no acertadas débiles y/o no específicas.
60. Demasiada espera para leer la placa luego de agregar la solución de detención Lea la placa inmediatamente luego de añadir la solución de detención
61. Alta concentración de anticuerpos Pruebe distintas soluciones de óptimos resultados.
62. incubación del sustrato se realiza a la luz La incubación del sustrato debe realizarse en la oscuridad o como lo recomiende el productor.
63. Se forma precipitado en los pocillos luego de la adición de sustrato Disminuya el factor de dilución de la muestra o disminuya la concentración del sustrato.
64. Placa sucia Limpie el fondo de la placa con un pañuelo

Solución de problemas de ELISA para

Falta de señal

65. Ningún anticuerpo de detección o uno incorrecto fue añadido añada el anticuerpo de detección apropiado y continúe
66. No se ha añadido avidina-HRP Añada avidina-HRP de acuerdo al protocolo y continúe
67. la solución de sustrato TMB no se ha añadido añada solución de sustrato y continúe
68. la solución de lavado contiene azida Evite la azida de sodio en la solución de lavado
69. El tiempo de incubación es demasiado corto Incube muestras durante la noche a 4ºC o siga las instrucciones del fabricante
70. Objetivo presente por debajo de los límites de detección del ensayo Disminuya el factor de dilución o concentre las muestras
71. Tipo de muestra incompatible La detección se puede reducir o ausentar en tipos de muestras no probadas. Incluya una muestra en la cual se sepa que el ensayo puede detectar el control posible
72. Reconocimiento del epítopo impedido por la placa de absorción Para mejorar la detección de un péptido por ELISA directo o indirecto, conjugue el péptido a una proteína portadora mayor antes de recubrir del recubrimiento sobre una placa microtituladora
73. Incompatibilidad de la solución del ensayo Asegúrese de que la solución del ensayo sea compatible con el objetivo de interés (por ejemplo, retención de la actividad enzimática, retención de las interacciones de las proteínas)
74. No hay suficiente reactivo de detección Aumente la concentración de la cantidad de reactivo de detección siguiendo las instrucciones del fabricante
75. Muestra preparada incorrectamente Asegure una preparación/dilución de la muestra apropiada. Las muestras pueden ser incompatibles con el formato del ensayo de placa microtituladora
76. Anticuerpos insuficientes Pruebe diferentes concentraciones/diluciones de anticuerpos
77. La temperatura de incubación es demasiado baja Asegúrese de que las incubaciones se realizan a la temperatura correcta. Todos los reactivos incluyendo las placas deben estar a temperatura ambiente o como lo recomiende el fabricante antes de proceder.
78. Longitud de ondas incorrecto Verifique la longitud de onda y lea la placa nuevamente
79. El lavado de la placa es demasiado vigoroso Verifique la presión correcta en el lavador de placas automático. Use la solución de lavado con las pipetas cuidadosamente en caso de que los lavados se realicen manualmente.
80. Pocillos secos No permita que los pocillos se sequen una vez que el ensayo haya comenzado. Cubra la placa usando film de sellado o cinta para todas las incubaciones.
81. Desarrollo lento del color de las reacciones enzimáticas Prepare solución de sustrato inmediatamente antes del uso. Asegúrese de que la solución madre no se haya vencido y de que no esté contaminada. Permita una incubación más larga.
82. Color desparejo Asegúrese de que todos los pocillos estén lavados correctamente . Use un lavador de placas ELISA cuando sea posible
83. Los reactivos no están a temperatura ambiente Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente desde el comienzo del ensayo. La temperatura ambiente debe alcanzarse luego de 15 a 20 minutos sobre la mesa.
84. Reactivos vencidos Asegúrese de que todos los reactivos estén dentro de la fecha válida
85. El formato del ensayo no es lo suficientemente sensible Cambie a un tipo de ensayo más sensible (por ejemplo, ELISA directo a ELISA tipo sándwich). Alargue los tiempos de incubación o aumente la temperatura. O cambie el método de detección
86. Solución que contiene FCS usada para reconstituir anticuerpos Reevalúe los reactivos usados.

Resolución de Problemas de ELISA para

Curva estándar pobre

87. El estándar se reconstituyó de forma incompleta o fue almacenado de forma incorrecta Reconstituya el estándar de acuerdo al protocolo provisto y siga las instrucciones de almacenamiento
88. Los reactivos fueron agregados a los pocillos en concentraciones incorrectas Verifique en búsqueda de errores del uso de pipeta y corrija el volumen del reactivo
89. Incubaciones realizadas a la temperatura incorrecta Siga el protocolo para el almacenamiento, incubación y agitación
90. Los pocillos no se aspiraron completamente Aspire completamente entre los pasos, use lavador de placas cuando sea posible
91. Placas apiladas durante la incubación Mantenga las placas separadas
92. Serie de diluciones pobres Verifique los pasos de dilución de acuerdo al protocolo
93. Reactivos mezclados pobremente Asegúrese de mezclar los reactivos completamente
94. Absorción variable o pobre de los reactivos a la placa Verifique la elección de solución de recubrimiento, normalmente PBS con un pH de 7,4 o una solución de carbonato bicarbonato de pH-9,6. Intente extender este tiempo de incubación o considere usar placas diferentes
95. Estándar degradado Verifique que el estándar se almacene correctamente
96. La curva no concuerda con la escala Pruebe diagramar usando diferentes escalas, por ejemplo: log-log, ajuste curvo de 5 parámetros logísticos
97. Error de uso de pipeta Verifique las pipetas y calíbrelas
98. El anticuerpo en captura no se pegó a la placa Asegúrese de estar usando una placa para ELISA, no una placa de cultivo de tejidos.
99. No hay suficiente anticuerpo de detección Verifique la dilución, valore si es necesario
100. Cálculos incorrectos de la dilución de curva estándar Verifique sus cálculos y cree una nueva curva
101. Mezclar o sustituir reactivos de diferentes kits Evite esto, ya que puede afectar la calidad de su ensayo