101 ELISA 문제 해결 팁

101 ELISA 문제 해결 팁

101 ELISA 문제 해결 팁 가이드는 연구원이 분석할 때 ELISA 키트와 관련된 일반적인 문제를 개선하고 해결하는 데 도움이 되도록 설계되었습니다. ELISA를 최적화하고 자주 발생하는 실수를 제거하면 결과와 ELISA 분석의 민감도를 크게 향상시킬 수 있습니다. 이 ELISA 문제 해결 안내서에서는 연구자가 ELISA에 문제가 발생하는 공통 영역에 대해 자세히 설명합니다.

ELISA 문제 해결 영역

높은 신호:

높은 신호는 플레이트 세척이 불충분하거나 반응을 멈추지 않고 너무 많은 검출 시약을 첨가하는 등 여러 가지 이유로 발생할 수 있습니다. 신호가 높으면 많은 오탐지와 잘못된 데이터가 발생할 수 있습니다.

범위를 벗어남:

때때로 이것은 샘플, 불충분 한 세척 또는 잘못된 희석 준비에 따라 발생할 수 있습니다. 이로 인해 음수 또는 결과가 없음으로 인해 데이터가 손실될 수 있습니다.

높은 변형:

높은 변동은 샘플 준비 실수, 파이펫 오류 및 불일치, 다른 문제 중 불충분 플레이트 교반 때문일 수 있습니다. 변동이 높은 데이터는 실제 결과를 왜곡하여 데이터에 불일치가 발생할 수 있습니다.

배경이 높음:

높은 배경은 부적절한 세척 단계, 시료의 교차 반응성 또는 오염으로 인해 발생할 수 있습니다. 다시 높은 배경은 오탐/음수 데이터가 발생하여 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

신호 없음:

ELISA 분석에서 신호가 나타나지 않을 수 있습니다. 세척 완충액에 아지 드가 포함되어 있거나 분석 대상 이하 또는 avidin-HRP가 첨가되지 않은 세척 완충액을 포함한 분석 kick 문제가 발생할 수 있습니다. 신호가 나타나지 않는 것은 귀중한 샘플에서 어떤 결과도 얻지 못했다는 의미이며 이러한 문제를 예방하기 위해 아래의 이유를 참고 하세요

불량 표준 곡선:

제대로 준비되지 않으면 불량한 표준 곡선이 발행할 수 없는 결과를 증명할 수 있습니다. 이유는 시약이 제대로 혼합 된 것을 포함 할 수있다, 표준이 저하 또는 파이펫팅 오류가 있습니다.


높은 신호에 대한 ELISA 문제 해결

시료의 희석 계수를 증가시키거나 기질의 농도를 감소시킵니다.

1.

TMB 기판 용액이 오염됨

우물을 첨가하기 전에 깨끗하고 무색이어야 하는 신선한 TMB 기판 용액을 사용하십시오. 기판 용액을 웰에 파이펫팅하기 전에 깨끗한 V 바닥 용기를 사용하십시오. 기판 용액을 웰에 파이펫팅하기 전에 깨끗한 V 바닥 용기를 사용하십시오.

2.

반응이 중지되지 않음

기판 반응이 멈추지 않으면 색상이 계속 발전합니다.

3.

플레이트 리더에서 읽기 전에 너무 오래 남아 있는 플레이트

색상은 계속 발전합니다 (중지 솔루션이 추가 된 경우 느린 속도로).

4.

실험실 유리 제품에서 오염 물질

시약이 신선하고 깨끗한 유리 제품에서 준비되었는지 확인합니다.

5.

빛에서 수행 된 기판 인큐베이션

기질 잠복은 어둠 속에서 수행되어야합니다. 기판이 빛에 노출되지 않도록 하고 어두운 곳에 보관하십시오. 어세이를 실행하는 동안 빛에 대한 노출을 제한하십시오.

6.

우물이 불충분하게 씻겨진다.

프로토콜 권장 사항에 따라 우물을 씻으십시오.

7.

너무 많은 검출 시약 추가

시약이 제대로 희석되었는지 확인하거나 검출 시약의 권장 농도를 낮추십시오.

8.

차단 버퍼가 비효율적 (예: 검출 시약이 차단제를 결합하고 우물이 완전히 차단되지 않음)

다른 차단 시약을 시도하거나 완충 세척에 차단 시약을 추가하십시오.

9.

배양/세척 버퍼의 소금 농도

염분 농도가 증가하면 비특이적 및/또는 약한 목표 외 상호 작용이 감소할 수 있습니다.

10.

높은 항체 농도

최적의 결과를 얻으려면 다른 희석제를 사용해보십시오.

11.

기판 첨가시 우물에 형성된 침전물

시료의 희석 계수를 증가시키거나 기질의 농도를 감소시킵니다.

12.

더티 플레이트

접시의 바닥을 청소하십시오.

13.

잘못된 표준 곡선 희석
준비

파이펫팅 기술을 확인하십시오. 파이펫의 교정이 필요할 수 있습니다.

14.

권장하는 것 보다 긴 배양 시간

잠복기가 올바른지 확인하고 기술 설명서와 함께 제공된 프로토콜을 준수하십시오.

15.

플레이트 실러 또는 시약 저장소가 재사용, 잔류 HRP의 존재를 초래. 이렇게하면 TMB 파란색이 비구체적으로 바뀝니다.

플레이트 실러를 재사용하면 잔류 HRP가 발생하여 TMB가 비특이적으로 변할 수 있습니다. 이것을 피하려면 각 단계마다 신선한 플레이트 실러와 시약 저장고를 사용하십시오.

16.

분류: 버퍼 오염

항상 신선한 버퍼를 만드십시오.


범위를 벗어나는 ELISA 문제 해결

17.

샘플에는 검출 가능한 수준의 분석물이 없습니다.

샘플이 검출 가능한 수준보다 낮을 경우 높은 시료를 사용할 수 있습니다. 적절한 프로토콜 수정은 기술 지원부에 문의하십시오.

18.

샘플에는 가장 높은 표준 점보다 높은 분석 물질 농도가 포함되어 있습니다.

샘플은 추가 희석이 필요할 수 있습니다.

19.

불충분 한 세척

적절한 세척 절차를 사용하십시오. 아래를 참조하십시오. 각 세척 단계가 끝나면 흡수 조직에 판을 뒤집어 완전히 배수하고 잔류 유체를 제거하기 위해 필요한 경우 강제로 도청 할 수 있습니다.

20.

사용 또는 재사용하지 않는 플레이트 실러

인큐베이션 동안, 플레이트 실러와 함께 어세이 플레이트를 덮으십시오. 플레이트가 열릴 때마다 신선한 실러를 사용하십시오. 이렇게하면 우물이 서로 오염되는 것을 방지 할 수 있습니다.

21

잘못된 희석 준비

파이펫팅 기술 확인 (아래 참조) 및 두 번 확인 계산.

22.

권장하는 것 보다 긴 배양 시간

제조된 키트에는 프로토콜이 최적화되어 있습니다. 권장되는 잠복기를 따라야 합니다. 항체 쌍을 사용하여 ELISA를 개발하는 경우 분석법을 최적화해야 할 수도 있습니다. 자세한 내용은 ELISA 개발 및 최적화를 참조하십시오.

23.

기판 용액이 너무 일찍 혼합되어 파란색으로 변함

기판 용액을 혼합하여 즉시 사용해야합니다.

24.

너무 많은 스트렙타비진-HRP

희석 확인, 필요한 경우 적정

25.

플레이트 실러 또는 시약 저장소가 재사용, 잔류 HRP의 존재를 초래. 이렇게하면 TMB 파란색이 비구체적으로 바뀝니다.

각 단계마다 신선한 플레이트 실러 및 시약 저장기 사용

26.

금속 또는 HRP로 오염 된 버퍼.

신선한 버퍼 만들기


높은 변동에 대한 ELISA 문제 해결

27.

다중 채널 파이펫 오류

파이펫 보정

28.

플레이트 세척이 적절하지 않거나 균일하지 않음

파이펫 팁이 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오. 모든 시약이 모든 세척 단계에서 완전히 제거되었는지 확인합니다.

29.

비균질성 표본

파이펫팅 전에 샘플을 철저히 혼합

30.

샘플에는 높은 특정 문제가 있을 수 있습니다.

원심 분리로 미립자 물질 제거

31.

불충분 한 판 교반

웰의 용액이 튀지 않고 일정한 속도로 ELISA 플레이트 쉐이커를 사용하여 모든 배양 단계에서 플레이트를 교반해야 합니다.

32.

교차 우물 오염

플레이트 실러를 재사용할 때 시약이 실러에 닿지 않았는지 확인하십시오. 시약 첨가에 사용되는 것과 동일한 피펫 팁을 사용할 때주의를 기울여야합니다. 파이펫 팁이 플레이트의 시약에 닿지 않도록 하십시오.

33.

인큐베이션 중에 쌓인 플레이트

플레이트를 쌓아 올리는 것은 플레이트의 우물에 균일 한 온도 분포를 허용하지 않습니다. 스태킹을 피하십시오.

34.

파이펫 불일치

파이펫이 올바르게 작동하고 교정되었는지 확인합니다. 파이펫 팁이 좋은 밀봉을 만들기 위해 충분히 멀리 밀려 있는지 확인합니다. 플레이트를 희석할 때 특히 주의를 기울여 파이펫 팁이 모두 올바른 양의 액체를 배출하고 있는지 확인하십시오.

35.

항체 희석/시약은 잘 혼합되지 않음

모든 유정에 걸쳐 일정한 농도를 유지하려면 플레이트에 파이펫팅하기 전에 모든 시약과 시료를 혼합해야 합니다.

36.

잘 말릴 수 있습니다.

배양 할 때 항상 뚜껑이 판에 남아 있는지 확인하십시오. 인큐베이터 바닥에 가습 물 트레이 (생수 깨끗한/멸균 물) 를 놓습니다.

37.

접시의 바닥이 더럽다.

플레이트를 다시 읽기 전에 플레이트의 바닥을 조심스럽게 청소하십시오.

38.

우물에 거품

플레이트를 판독하기 전에 기포가 없는지 확인합니다.

39.

가장자리 효과

플레이트와 모든 시약이 실온에 있는지 확인합니다.

40.

스토리지

시약과 시료가 올바른 온도인지 확인

41.

포획 항체는 접시에 결합하지 않았다.

당신이 ELISA 플레이트를 사용하고 있는지 확인, 하지 조직 배양 판. PBS에서 항체를 희석하십시오. 코팅 및 차단 단계 모두에 대해 올바른 준비 및 배양 시간을 보장합니다.

42.

분류: 프로토콜의 변형

귀하의 시기와 함께 제공되는 프로토콜을 준수하십시오.

43.

표준 곡선의 부적절한 계산

계산 확인, 새로운 표준 곡선 만들기 및 내부 컨트롤 사용

44.

오염된 버퍼

신선한 버퍼 사용

45.

잘 바닥 폐기

파이펫팅 중에 우물 바닥과의 접촉을 피하십시오. 바닥을 방해하지 않도록 파이펫 팁을 우물 측면으로 조준하십시오.

배경에 대한 ELISA 문제 해결이 높음

46.

배경 우물이 오염되었다.

실러를 적절하게 사용하여 교차 웰 오염을 방지하십시오. 플레이트의 시약을 만지지 않고 멀티 채널 파이펫을 사용하십시오.

47.

사용된 매트릭스는 내인성 분석물질 또는 간섭을 가지고 있습니다.

교차 반응 성분 (예: 인터루킨 변형 조직 배양 매체) 에 대한 매트릭스 성분을 확인하십시오.

48.

세척 부족

세척 횟수를 늘립니다. 기판 용액을 첨가하기 전에 세척 사이의 침지 시간을 늘립니다.

49.

상호 반응성

검출 항체는 코팅 항체와 교차 반응합니다. 적절한 컨트롤을 실행합니다.

50.

항체의 비특이적 결합

블록 단계가 포함되고 적절한 차단 버퍼가 사용되고 있는지 확인합니다. 2 차 항체 또는 소 혈청의 동일한 종에서 5 ~ 10% 의 혈청을 사용하는 것이 좋습니다. 비특이적 부착을 방지하기 위해 우물 사전 처리 보장 친화성 정제 항체, 바람직하게는 사전 흡수됨

51.

공액 제 2의 농도 항체가 너무 높음

최적의 작업 농도를 결정하기 위해 희석제를 수행하십시오.

52.

잘못된 측정 온도

배양 온도가 37°C를 초과하지 않았는지 확인합니다.

53.

부적절한 세척

모든 우물이 세척 버퍼로 채워지고 완전히 흡인되고 있는지 확인하십시오. 가능한 경우 자동 플레이트 와셔를 사용하십시오. 세척 횟수를 늘립니다. 세척 사이에 30초 담가 단계를 추가합니다.

54.

시료에 존재하는 오염 효소

오염 효소 활성을 확인하기 위해 기판만으로 샘플을 테스트합니다.

55.

우물이 불충분하게 씻겨진다.

세척 우물은 프로토콜 권장 사항에 따라 제공됩니다.

56.

오염된 워시 버퍼

신선한 버퍼 준비

57.

너무 많은 검출 시약

시약이 적절하게 희석되었는지 확인하거나 검출 시약의 권장 농도를 낮추십시오.

58.

차단 버퍼가 비효율적

다른 차단 완충 시약을 시도하거나 완충 세척에 차단 시약을 추가하십시오.

59.

배양/세척 버퍼의 소금 농도

염분 농도가 증가하면 비특이적 및/또는 표적 상호 작용이 약해질 수 있습니다.

60.

정지 용액 추가 후 플레이트를 읽기에 너무 오래 기다리십시오.

정지 용액 추가 직후 플레이트 판독

61.

높은 항체 농도

최적의 결과의 다른 희석 시도

62.

기판 인큐베이션은 빛에서 수행된다.

기질 인큐베이션은 어둠 속에서 또는 제조업체가 권장하는대로 수행해야합니다.

63.

기판 첨가시 우물에 형성된 침전물

시료의 희석 계수 증가 또는 기질 농도 감소

64.

더티 플레이트

와이프로 플레이트의 바닥을 청소하십시오.

신호 없음을위한 ELISA 문제 해결

65.

부정확하거나 검출 항체가 추가되지 않았습니다.

적절한 검출 항체를 추가하고 계속 진행합니다.

66.

Avidin-hrp가 추가되지 않았습니다.

프로토콜에 따라 Avidin-HRP를 추가하고 계속하십시오

67.

기판 솔루션이 추가되지 않았습니다.

기판 솔루션 추가 및 계속

68.

워시 버퍼에 아지드가 포함되어 있습니다

세척 완충기에서 나트륨 아지드를 피하십시오.

69.

잠복기 시간이 너무 짧음

4'C에서 야간에 샘플을 배양하거나 제조업체 지침을 따르십시오.

70.

검출 한계 이하의 대상 존재

희석 계수 감소 또는 시료 농축

71.

호환되지 않는 샘플 유형

테스트되지 않은 샘플 유형에서는 검출이 감소되거나 없을 수 있습니다. 분석이 양의 제어를 탐지하는 것으로 알려진 표본 포함

72.

흡수 플레이트에 의해 방해되는 에피토프 인식

직접 또는 간접 ELISA에 의한 펩타이드의 검출을 강화하기 위해, 마이크로 타이터 플레이트에 코팅하기 전에 대형 캐리어 단백질에 펩타이드를 접합합니다.

73.

버퍼 비호환성

어세이 버퍼가 관심 대상 (예: 효소 활성 유지, 단백질 상호 작용 유지) 과 호환되는지 확인합니다.

74.

Not enough detection reagent

제조업체 지침에 따라 검출 시약의 농도 증가

75.

샘플이 잘못 준비됨

적절한 시료 준비/희석이 보장됩니다. 샘플은 마이크로 타이터 플레이트 분석 형식과 호환되지 않을 수 있습니다.

76.

불충분 한 항체

항체의 다른 농도/희석 시도

77.

배양 온도가 너무 낮습니다.

인큐베이션이 올바른 온도에서 수행되는지 확인하십시오. 플레이트를 포함한 모든 시약은 실온 또는 진행하기 전에 제조업체가 권장하는 바에 따라 보관해야 합니다.

78.

잘못된 파장

파장을 확인하고 플레이트를 다시 읽습니다.

79.

플레이트 세척이 너무 활발합니다.

자동 플레이트 와셔의 올바른 압력을 확인하십시오. 수동으로 세척하는 경우 파이펫 워시 완충 완충.

80.

웰스 건조

일단 어세이가 시작되면 우물이 마르지 않도록하십시오. 모든 배양을위한 밀봉 필름 또는 테이프를 사용하여 플레이트를 덮으십시오.

81.

효소 반응의 느린 색 개발

사용 직전에 기판 용액을 준비하십시오. 스톡 용액이 만료되지 않았으며 오염되지 않았는지 확인합니다. 더 긴 인큐베이션을 허용합니다.

82.

고르지 않은 색상

모든 우물이 올바르게 세척되었는지 확인하고 가능한 경우 ELISA 플레이트 와셔를 사용하십시오.

83.

 

실온이 아닌 시약

모든 시약은 측정 시작부터 실온에 있어야합니다. 실온은 벤치에서 15~20분 후에 도달해야 합니다.

84.

만료된 시약

사용된 모든 시약이 날짜 내에 있는지 확인

85.

충분히 민감하지 않은 어세이 형식

보다 민감한 어세이 유형으로 전환합니다 (예: ELISA 샌드위치 ELISA). 잠복기를 길게하거나 온도를 높입니다. 또는 탐지 방법 변경

86.

항체를 재구성하는 데 사용되는 FCS를 포함하는 버퍼

사용된 시약을 재평가합니다.

불량한 표준 곡선에 대한 ELISA 문제 해결

87.

표준이 불완전하게 재구성되었거나 잘못 저장되었습니다.

프로토콜에 따라 표준 재구성 제공 및 저장 지침을 따르십시오.

88.

시약이 잘못된 농도로 우물에 첨가되었습니다.

파이펫팅 오류 확인 및 시약 부피 수정

89.

잘못된 온도에서 수행 된 인큐베이션

저장, 인큐베이션 및 교반 프로토콜을 따르십시오.

90.

완전히 흡인되지 않은 웰스

단계 사이에 완전히 흡인하고 가능한 경우 플레이트 세척을 사용하십시오.

91.

인큐베이션 중에 쌓인 플레이트

플레이트를 분리된 상태로 유지

92.

불량 희석 시리즈

프로토콜에 따라 희석 단계 확인

93.

약한 혼합 시약

시약을 철저히 혼합하십시오.

94.

플레이트에 대한 시약의 흡착이 불량하거나 가변적일 수 있습니다.

코팅 버퍼의 선택, 일반적으로 7.4 또는 탄산 중탄산염 버퍼 pH 9.6의 pH를 가진 PBS. 이 배양 시간을 연장하거나 다른 플레이트 사용을 고려하십시오.

95.

표준 성능 저하

표준이 올바르게 저장되었는지 확인하십시오.

96.

곡선이 축척에 맞지 않습니다.

다른 척도 (예: 로그 로그, 5 매개 변수 로지스틱 곡선 맞춤) 를 사용하여 플로팅 해보십시오.

97.

파이펫팅 오류

파이펫 확인 및 교정

98.

포획 항체는 접시에 결합하지 않았다.

당신이 ELISA 플레이트를 사용하고 있는지 확인, 하지 조직 배양 판.

99.

검출 항체가 충분하지 않음

희석 확인, 필요한 경우 적정

100.

잘못된 표준 곡선 희석 계산

계산을 확인하고 새 곡선을 만듭니다.

101.

다른 키트의 시약 혼합 또는 대체

이 방법은 귀하의 시사 품질에 영향을 미칠 수 있으므로 피하십시오.


ELISA Troubleshooting & Tips