101 ELISAトラブルシューティングのヒント

101 ELISAトラブルシューティングのヒント

101 ELISAトラブルシューティングのヒントガイドは研究者が分析するときELISAキットに関連する一般的な問題を改善し、解決するのに役立つように設計されました。 ELISAを最適化し、頻繁に発生するミスを削除すると、結果とELISA分析の感度を大幅に向上させることができます。このELISAトラブルシューティングガイドでは、研究者がELISAで問題が発生する共通領域の詳細について説明します。

ELISAトラブルシューティング領域

高電波:

高信号は、プレートの洗浄が不十分である、反応が停止しない、検出試薬が多すぎるなど、さまざまな理由で発生します。 信号が高い場合、これにより多くの誤検知と不正なデータが発生する可能性があります。

範囲外:

これは、サンプル、不十分な洗浄、または誤った希釈の準備に基づいて発生する場合があります。 これにより、否定的な結果または結果なしによりデータが失われる可能性があります。

高バリエーション:

ばらつきが大きいのは、サンプル調製のミス、ピペットのエラーと矛盾、プレートの攪拌不足などが原因です。 変動の大きいデータは、実際の結果を歪め、データに不整合を引き起こす可能性があります。

배경이 背景が高い:

不十分な洗浄ステップ、サンプルの交差反応性または汚染により、バックグラウンドが高くなる場合があります。 ここでも、バックグラウンドが高いと、偽陽性/陰性データになり、結果に影響を与える可能性があります。

でんぱわるい:

エリザアッセイでは、洗浄バッファーにアジドが含まれている、アッセイの検出下のターゲット、またはアビジン-HRPが添加されていないなど、多数のサンプルおよびアッセイの問題からシグナルが発生することはありません 貴重なサンプルからの結果が得られないというシグナルがない場合は、これらの問題を回避するために以下の理由を読んでください。

貧弱な標準曲線:

貧弱な標準曲線は、正しく準備されていなければ、公開不可能な結果を証明します。 試薬が十分に混合されていない、標準が劣化またはピペッティングエラーになっているなどの理由があります。


高い信号のELISAトラブルシューティング

追加された検出試薬が多すぎる

1.

TMB基質溶液 が汚染された

ウェルに加える前に透明で無色でなければならない新鮮なTMB基質溶液を使用してください。 基質溶液をウェルにピペッティングする前に、清潔なV底容器を使用します。 基質溶液をウェルにピペッティングする前に、清潔なV底容器を使用します。

2.

反応が停止していません

基質反応が停止しない場合、色は発色し続けます。

3.

プレートリーダーで読み取る前にプレートが長すぎます

色は発色し続けます(ただし、停止溶液が追加されている場合はより遅い速度で)

4.

実験用ガラス器具からの汚染物質

試薬が新鮮で、清潔なガラス器具で準備されていることを確認してください。

5.

光の中で行われる基質インキュベーション

基質のインキュベーションは暗所で行ってください。 素材が光にさらされないようにしてください。暗い場所に保管してください。 アッセイの実行中は、光への暴露を制限してください。

6.

ウェルの洗浄が不十分です

プロトコルの推奨事項に従ってウェルを洗浄します。

7.

追加された検出試薬が多すぎる

試薬が適切に希釈されていることを確認するか、検出試薬の推奨濃度を下げます

8.

ブロッキングバッファーが無効(検出試薬がブロッカーに結合する、ウェルが完全にブロックされていないなど)

別のブロッキング試薬を試すか、洗浄バッファーにブロッキング試薬を追加します。

9.

インキュベーション/洗浄バッファーの塩濃度

塩濃度を上げると、非特異的および/または弱いオフターゲット相互作用を減らすことができます。

10.

高抗体濃度

最適な結果を得るには、異なる希釈を試してください。

11.

基質添加時にウェル内に沈殿物が形成される

サンプルの希釈率を上げるか、基質の濃度を下げます。

12.

汚れたプレート

プレートの底をきれいにします。

13.

誤った標準曲線希釈 準備した

ピペッティング技術を確認してください。 ピペットのキャリブレーションが必要になる場合があります。3

14.

より長いインキュベーション時間 お勧め

インキュベーション時間が正しいことを確認し、技術マニュアルに記載されているプロトコルに従ってくださ

15.

プレートシーラーまたは試薬リザーバーを再利用したため、HRPが残っていました。 これにより、TMBが非特異的に青になります

プレートシーラーの再利用は、残留HRPの存在につながり、TMBの非特定の色の変化につながる可能性があります。 これを回避するには、各ステップで新しいプレートシーラーと試薬リザーバーを使用します。

16.

バッファーの汚染

常に新しいバッファーを作成します。


範囲外のELISAトラブルシューティング

適切な洗浄手順を使用します。以下を参照してください。 各洗浄ステップの最後に、吸収性ティッシュのプレートを裏返して完全に排出させ、必要に応じて残留液を取り除くために強く叩きます。

17.

サンプルには、分析対象物の検出可能なレベルが含まれていないか、含まれています

サンプルが検出可能なレベルを下回っている場合、大量のサンプルを使用できる可能性があります。 適切なプロトコルの変更については、テクニカルサポートに確認してください。

18.

サンプルには、最高基準点よりも高い検体濃度が含まれています

サンプルはさらに希釈する必要があります

19.

不十分な洗浄

適切な洗浄手順を使用します。以下を参照してください。 各洗浄ステップの最後に、吸収性ティッシュのプレートを裏返して完全に排出させ、必要に応じて残留液を取り除くために強く叩きます。

20.

使用または再利用されていないプレートシーラー

インキュベーション中に、アッセイプレートをプレートシーラーで覆います。 プレートを開くたびに新しいシーラーを使用してください。 これにより、ウェルが互いに汚染するのを防ぎます。

21

誤った希釈液を準備しました

ピペッティング手法を確認します(以下を参照)。計算を再確認します。

22.

より長いインキュベーション時間お勧め

製造キットにはプロトコルが最適化されています。 推奨されるインキュベーション時間に従ってください。 抗体ペアを使用してELISAを開発する場合、アッセイを最適化する必要があります。 詳細については、エリサの開発と最適化を参照してください。

23.

基質溶液の混合が早すぎて青色に変わった

基質溶液は混合してすぐに使用する必要があります

24.

ストレプトアビジン-HRPが多すぎる

希釈を確認し、必要に応じて滴定します

25.

プレートシーラーまたは試薬リザーバーを再利用したため、HRPが残っていました。 これにより、TMBが非特異的に青になります

各ステップに新しいプレートシーラーと試薬リザーバーを使用します

26.

金属またはHRPで汚染されたバッファー。

新鮮なバッファーを作る


高い変動に対するELISAトラブルシューティング

27.

マルチチャンネルピペットエラー

ピペットを較正する

28.

プレート洗浄が適切または均一ではなかった

ピペットチップがしっかりと固定されていることを確認してください。 すべての洗浄ステップですべての試薬が完全に除去されたことを確認します

29.

不均質なサンプル

ピペッティングの前にサンプルを完全に混合します

30.

サンプルには特定の問題がある可能性があります

遠心分離により粒子状物質を除去する

31.

クロスウェル汚染

ウェルの溶液が目立たず、一定の速度でELISAプレートシェーカーを使用して、すべての培養段階でプレートを撹拌する必要があります。

32.

クロスウェル汚染

プレートシーラーを再利用するときは、試薬がシーラーに触れていないことを確認してください。 試薬の追加に使用したのと同じピペットチップを使用する場合は注意が必要です。 ピペットチップがプレート上の試薬に触れないようにしてください。

33.

インキュベーション中に積み重ねられたプレート

プレートを積み重ねると、プレートのウェル全体に温度を均一に分散できません。 積み重ねないでください。

34.

ピペットが矛盾しています

ピペットが正しく機能し、較正されていることを確認してください。 良好なシールを作成するために、ピペットチップが十分に押し込まれていることを確認してください。 プレートを希釈するときは特に注意し、ピペットチップがすべて拾い上げて正しい量の液体を放出していることを確認してください。

35.

抗体希釈液/試薬が十分に混合されていません

すべてのウェルで一貫した濃度を確保するために、プレートにピペッティングする前にすべての試薬とサンプルが混合されていることを確認してください。

36.

よく乾かします

培養中は常に蓋がプレートに残っていることを確認してください。 インキュベーターの底に加湿水トレイ(ボトル入りのきれいな/滅菌水)を置きます

37.

プレートの底が汚れている

プレートを再度読む前に、プレートの底を慎重に清掃してください

38.

井戸の泡

プレートを読む前に気泡がないことを確認してください

39.

エッジ効果

プレートとすべての試薬が室温であることを確認してください

40.

ストレージ

試薬とサンプルが正しい温度で保管されていることを確認してください

41.

捕捉抗体がプレートに結合しませんでした

組織培養プレートではなく、ELISAプレートを使用していることを確認してください。 PBSで抗体を希釈します。 コーティングとブロッキングの両方のステップのための正しい準備とインキュベーション時間を確認してください。

42.

プロトコルのバリエーション

アッセイに付属のプロトコルを順守してください

43.

標準曲線の不適切な計算

計算をチェックし、新しい標準曲線を作成し、内部統制を使用する

44.

汚染されたバッファー

新鮮なバッファーを使用する

45.

よく底が廃棄された

ピペッティング中にウェルの底に触れないようにしてください。 ピペットチップをウェルの側面に向けて、底が崩れないようにします

背景のELISAトラブルシューティングが高い

46.

バックグラウンドウェルが汚染された

シーラーを適切に使用して、クロスウェル汚染を避けてください。 プレート上の試薬に触れることなくマルチチャンネルピペットを使用してください。

47.

使用されるマトリックスに内因性の検体または干渉がある

交差反応成分のマトリックス成分を確認します(インターロイキン変性組織培養培地など)。

48.

不十分な洗浄

洗浄回数を増やします。 基質溶液を添加する前に、洗浄間の浸漬時間を増やします。

49.

交差反応性

コーティング抗体と交差反応する検出抗体。 適切なコントロールを実行します。

50.

抗体の非特異的結合

ブロックステップが含まれており、適切なブロッキングバッファーが使用されていることを確認します。 同じ種類の二次抗体の5〜10%の血清、またはウシ血清を使用することをお勧めします。 非特異的な付着を防ぐためにウェルが前処理されていることを確認します

51.

結合二次抗体の濃度が高すぎる

希釈を実行して、最適な作業濃度を決定します。

52.

誤ったアッセイ温度

インキュベーション温度が37°Cを超えていないことを確認してください

53.

不十分な洗浄

すべてのウェルが洗浄バッファーで満たされ、完全に吸引されていることを確認します。 利用可能な場合は、自動プレートウォッシャーを使用します。 洗浄回数を増やします。 洗浄の間に30秒の浸漬ステップを追加します。

54.

サンプルに存在する汚染酵素

基質のみでサンプルをテストし、汚染酵素活性を確認します。

55.

ウェルの洗浄が不十分です

洗浄ウェルはプロトコルごとの推奨事項です。

56.

汚染された洗浄バッファー

新しいバッファーを準備する

57.

検出試薬が多すぎる

試薬が適切に希釈されていることを確認するか、検出試薬の推奨濃度を下げます

58.

無効なブロッキングバッファー

別のブロッキングバッファー試薬を試す、および/または洗浄バッファーにブロッキング試薬を追加する

59.

インキュベーション/洗浄バッファーの塩濃度

塩濃度を上げると、非特異的および/または弱いオフターゲット相互作用を減らすことができます。

60.

停止液の添加後、プレートを読み取るのに時間がかかりすぎています

停止液を加えた直後にプレートを読む

61.

高抗体濃度

最適な結果のさまざまな希釈を試してください

62.

基質のインキュベーションは光の中で行われます

基質のインキュベーションは、暗所で、または製造元が推奨するとおりに行う必要があります。

63.

基質添加時にウェル内に沈殿物が形成される

시료의 희석 계수 증가 또는 기질 농도 감소

64.

汚れたプレート

ワイプでプレートの底をきれいにします

信号無しのためのELISAトラブルシューティング

65.

検出抗体が誤って追加されたか、追加されなかった

適切な検出抗体を追加して続行します

66.

Avidin-HRPは追加されませんでした

プロトコルに基づいてAvidin-HRPを追加して続行します

67.

基質溶液は添加されませんでした

基質溶液を追加して続行

68.

洗浄バッファーにはアジドが含まれています

洗浄バッファーにはアジ化ナトリウムを使用しないでください

69.

インキュベーション時間が短すぎます

4'Cで夜間にサンプルを培養するか、製造元の指示に従ってください。

70.

アッセイの検出限界以下のターゲット

希釈率を下げるか、サンプルを濃縮します

71.

互換性のないサンプルタイプ

テストされていないサンプルの種類では、検出が減少または欠落する場合があります。 アッセイが陽性対照を検出することが知られているサンプルを含める

72.

吸収プレートによって妨げられたエピトープの認識

直接または間接ELISAによるペプチドの検出を強化するには、マイクロタイタープレートにコーティングする前にペプチドを大きなキャリアタンパク質に結合させます

73.

アッセイバッファーの非互換性

アッセイバッファーが目的のターゲットと互換性があることを確認します(酵素活性の保持、タンパク質相互作用の保持など)

74.

不十分な検出試薬

メーカーのガイドラインに従って検出試薬の量の濃度を上げる

75.

誤って準備されたサンプル

適切なサンプル調製/希釈を確認してください。 サンプルは、マイクロタイタープレートアッセイ形式と互換性がない可能性があります

76.

不十分な抗体

抗体の異なる濃度/希釈を試してください

77.

インキュベーション温度が低すぎる

インキュベーションが正しい温度で行われていることを確認してください。 プレートを含むすべての試薬は、室温にするか、続行する前に製造元の推奨に従ってください。

78.

間違った波長

波長を確認し、プレートを再度読み取ります

79.

プレート洗浄が強すぎる

自動プレートウォッシャーの正しい圧力を確認します。 手動で洗浄する場合は、ピペットでバッファーを静かに洗浄します。

80.

ウェルズドライ

アッセイが開始したら、ウェルを乾燥させないでください。 すべてのインキュベーションのために、シーリングフィルムまたはテープを使用してプレートを覆います。

81.

酵素反応の遅い発色

使用直前に基質溶液を調製します。 ストック溶液の有効期限が切れておらず、汚染されていないことを確認してください。 より長いインキュベーションを可能にします。

82.

色むら

すべてのウェルが正しく洗浄されていることを確認し、可能であればELISAプレートウォッシャーを使用してください

83.

 

室温ではない試薬

すべての試薬は、アッセイの開始から室温でなければなりません。 ベンチで15〜20分後に室温に達する必要があります。

84.

期限切れの試薬

使用するすべての試薬が期限内であることを確認してください

85.

抗体の再構成に使用されるFCSを含むバッファー

より感度の高いアッセイタイプに切り替えます(例:直接ELISAからサンドイッチELISA)。 インキュベーション時間を長くするか、温度を上げます。 または、検出方法を変更します

86.

항체를 재구성하는 데 사용되는 FCS를 포함하는 버퍼

使用した試薬を再評価します。

貧弱な標準曲線のELISAトラブルシューティング

試薬のプレートへの不十分または可変の吸着

87.

標準が不完全に再構成されたか、誤って保存された

プロトコルに従って標準を再構成し、保管指示を提供し、それに従ってください

88.

試薬が誤った濃度でウェルに追加された

ピペッティングエラーを確認し、試薬量を修正します

89.

不正確な温度で行われたインキュベーション

保存、インキュベーション、および攪拌のためのプロトコルに従ってください

90.

ウェルが完全に吸引されていない

ステップ間で完全に吸引し、可能な場合はプレート洗浄を使用します

91.

インキュベーション中に積み重ねられたプレート

プレートを分離しておく

92.

低希釈シリーズ

プロトコルに従って希釈ステップを確認します

93.

試薬の混合不良

試薬を完全に混合するようにしてください

94.

試薬のプレートへの不十分または可変の吸着

通常、pH 7.4のPBSまたはpH 9.6の炭酸水素塩緩衝液のコーティング緩衝液の選択を確認します。 このインキュベーション時間を延長するか、異なるプレートの使用を検討してください

95.

標準劣化

標準が正しく保存されたことを確認します

96.

曲線がスケールに適合しない

別のスケールを使用してプロットを試してください。 log-log、5パラメーターロジスティックカーブフィット

97.

ピペッティングエラー

ピペットを確認して較正する

98.

捕捉抗体がプレートに結合しませんでした

組織培養プレートではなく、ELISAプレートを使用していることを確認してください。

99.

十分な検出抗体

希釈を確認し、必要に応じて滴定します

100.

標準曲線希釈の誤った計算

計算を確認して、新しい曲線を作成します。

101.

さまざまなキットの試薬の混合または代替

アッセイの品質に影響を与える可能性があるため、これは避けてください

Author: Seán Mac Fhearraigh PhD

ELISA Troubleshooting & Tips