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101 Astuces Dépannage ELISA

101 Astuces Dépannage ELISA


101 Astuces Dépannage ELISA


Notre guide 101 Astuces Dépannage ELISA est conçu pour vous aider à améliorer et à régler les problèmes les plus fréquents que les chercheurs rencontrent lors de la réalisation de leurs expériences avec des kits ELISA. Optimiser votre ELISA et vous débarrasser des erreurs fréquemment faites peuvent améliorer de manière substantielle vos résultats ainsi que la sensibilité de vos tests.


Dans ce guide dépannage ELISA nous avons détaillé les principales sections dans lesquelles les chercheurs rencontrent des problèmes lors de leurs tests, à savoir :
 

  • Un signal trop fort : ceci peut arriver pour plusieurs raisons, incluant ne pas laver suffisamment les plaques, mal stopper la réaction ou ajouter trop de réactif de détection. Un signal trop fort peut générer de nombreux faux positifs et mener à des données incorrectes.
     
  • Un signal hors gamme : ceci peut parfois résulter de la nature même des échantillons, d’une erreur de dilution lors de la préparation des échantillons ou d’un mauvais lavage des plaques
  • De fortes variabilités : ceci peut être dû, entre autres, à des erreurs lors de la préparation des échantillons (erreurs ou inexactitudes de pipetage) ou encore à une agitation insuffisante de la plaque. De fortes variations peuvent biaiser vos résultats réels et causer des incohérences dans vos données.
  • Un fort bruit de fond : ceci peut résulter d’étapes de lavage insuffisantes, d’une interaction non-spécifique des échantillons avec les réactifs ou d’une contamination. Une fois de plus, un bruit de fond élevé peut entrainer des faux-positifs/négatifs et affecter vos résultats.
  • Aucun signal : ceci peut résulter de nombreux problème allant de l’échantillon au protocole expérimental lui- même, tels que la présence d’azide dans le tampon de lavage, une concentration de l’analyte cible sous le seuil de détection, ou un oubli d’un des réactifs. Aucun signal peut signifier aucun résultat pour vos échantillons (parfois précieux), s’il ne vous est pas possible de recommencer le test.
  • Une courbe standard suboptimale : ceci peut être le fruit de réactifs mal homogénéisés, d’une dégradation du standard ou d’erreurs de pipetage. Une courbe standard non-adaptée ne vous permettra pas de publier vos résultats.

Astuces dépannage ELISA pour un signal trop fort :

1.

Contamination de la solution de substrat
TMB.

Utiliser une solution de substrat fraîchement préparée, qui doit
être limpide et transparente avec de l’ajouter aux puits. Utiliser
un tube à fond V propre comme conteneur avant de pipeter la
solution dans les puits.

2.

Réaction non stoppée.

La couleur continuera à s’intensifier si la réaction de révélation n’est pas stoppée.

3.

Lecture de la plaque trop longtemps après le
début de la révélation.

La couleur continuera à s’intensifier, bien qu’à un rythme plus
lent si une solution stop a été ajoutée.

4.

Contamination par la verrerie du laboratoire.

S’assurer que les réactifs sont fraîchement préparés dans des récipients propres.

5.

Incubation du substrat à la lumière.

L’incubation du substrat doit être réalisée à l’obscurité. S’assurer que le substrat n’est pas exposé à la lumière, le stocker dans un endroit sombre. Limiter l’exposition à la lumière autant que possible durant le test.

6.

Lavage insuffisant des puits.

Laver les puits selon les recommandations du protocole.

7.

Ajout excessif du réactif de détection.

S’assurer que le réactif a été dilué de manière adéquate ou diminuer la concentration recommandée si besoin.

8.

Tampon de saturation ineffectif (ex : le réactif
de détection se lie au réactif de saturation ;
les puits ne sont pas complètement saturés).

Essayer un tampon de saturation différent, et/ou ajouter le réactif de saturation au tampon de lavage.

9.

Concentrations salines des tampons de
dilution ou de lavage.

Augmenter les concentration salines peut réduire les interactions faibles et/ou non-spécifiques.

10.

Concentration élevée d’anticorps.

Essayer différentes dilutions pour des résultats optimaux.

11.

Formation d’un précipité dans les puits après
addition du substrat.

Augmenter le facteur de dilution de l’échantillon ou diminuer la
concentration du substrat.

12.

Plaque sale.

Nettoyer le dessous de la plaque.

13.

Préparation incorrecte des dilutions de la
courbe standard.

Vérifier la technique de pipetage. Une calibration des pipettes
peut être requise.

14.

Temps d’incubation plus longs que
recommandés.

S’assurer que les temps d’incubation sont corrects et
correspondent au protocole fourni avec le manuel technique.

15.

Réutilisation des films pour sceller la plaque
ou des réservoirs à réactifs.

Réutiliser les mêmes films pour sceller les plaques, ou les mêmes réservoirs à réactifs, d’une expérience à l’autre peut conduire à la présence résiduelle d’enzyme HRP, menant à un changement de couleur non-spécifique du substrat. Afin d’éviter ceci, utiliser du matériel propre à chaque fois.

16.

Contamination des solutions.

Toujours préparer des solutions fraîches.


Astuces dépannage ELISA pour un signal hors gamme :

17.

Analyte absent de l’échantillon ou présent à
une concentration sous le seuil de détection.

Si les échantillons sont sous le seuil de détection même non
dilué, il est possible d’utiliser un plus grand volume pour
l’incubation. S’enquérir auprès du service de support technique
pour les modifications à apporter au protocole si tel est le cas.

18.

Concentration de l’analyte dans l’échantillon
supérieure au plus haut point de la gamme.

Les échantillons peuvent avoir besoin d’être dilués d’avantage.

19.

Lavage insuffisant.

Utiliser une procédure de lavage adéquate (cf ci-dessous). A la
fin de chaque étape de lavage, renverser la plaque sur du papier
absorbant pour sécher les puits. Ne pas hésiter à taper vigoureusement la plaque sur le papier si nécessaire pour
éliminer le liquide résiduel.

20.

Pas d’utilisation de film pour sceller la plaque,
ou réutilisation de films souillés.

Durant les incubations, sceller les plaques avec un film. Prendre un nouveau film à chaque étape. Cela permettra d’éviter une contamination entre les puits.

21

Préparation incorrecte des dilutions.

Vérifier le pipetage (cf ci-dessous) et les calculs.

22.

Temps d’incubation plus longs que
recommandés.

Les kits manufacturés ont des protocoles optimisés. S’assurer de suivre les temps d’incubation recommandés. En case de développement d’un test ELISA utilisant des pairs d’anticorps à façon, il peut être nécessaire d’optimiser l’essai.

23.

Préparation de la solution de substrat trop à
l’avance.

La solution de substrat doit être préparée fraîchement juste
avant utilisation. Sans cela, la solution changera de couleur de
manière non-spécifique.

24.

Excès de conjugué enzymatique (ex :
streptavidine-HRP).

Vérifier la dilution. Titrer, si nécessaire.

25.

Réutilisation des films pour sceller les plaques
ou des réservoirs à réactifs.

Utiliser du matériel propre à chaque fois.

26.

Contamination des solutions.

Préparer des solutions fraîches.


Astuces dépannage ELISA pour une forte variabilité :

27.

Erreurs de calibrage des pipettes.

S’assurer de la bonne calibration de toutes les pipettes (y compris multicanaux) utilisées.

28.

Lavage non-optimal ou non-uniforme des
plaques.

S’assurer que les cônes de pipettes tiennent bien. S’assurer que
les réactifs sont complètement éliminés à chaque étape de
lavage.

29.

Echantillons non-homogènes.

Mélanger vigoureusement les échantillons avant de pipeter.

30.

Concentration excessive de particules en
suspension dans les échantillons.

Se débarrasser des particules en suspension par centrifugation.

31.

Agitation insuffisante de la plaque.

La plaque doit être agitée durant les étapes d’incubation en
utilisant un agitateur de plaque, à une vitesse permettant aux
solutions dans les puits d’être en agitation constante sans pour
autant déborder.

32.

Contamination entre puits.

En cas de réutilisation des films pour sceller les plaques,
s’assurer qu’aucun réactif n’a touché le film. Faire attention si
les mêmes cônes de pipettes sont utilisés pour déposer les
réactifs dans les puits. S’assurer que les cônes ne touchent pas
les réactifs dans la plaque.

33.

Empilement des plaques durant les incubations.

L’empilement des plaques ne permet pas une répartition
homogène de la température parmi les puits. Ne pas empiler les
plaques.

34.

Inexactitude de pipetage.

S’assurer que les pipettes utilisées fonctionnent correctement
et sont calibrées. S’assurer que les cônes à pipettes sont
enfoncés suffisamment. Faire attention lors de la préparation
de dilutions en plaque, et s’assurer que les cônes aspirent et
refoulent un volume correct de liquide.

35.

Mauvaise homogénéisation des dilutions
d’anticorps/de réactifs.

Pour assurer une concentration comparable parmi les puits,
s’assurer que les réactifs et les échantillons sont bien
homogénéiser avant de les pipetter dans les plaques.

36.

Assèchement des puits.

S’assurer que la plaque est scellée durant les incubations. Placer
un plateau d’eau humidifiant (eau en bouteille/stérile) au fond
de l’incubateur.

37.

Dessous de la plaque sale.

Nettoyer avec soin le dessous de la plaque avant de relire les plaques.

38.

Présence de bulles d’air dans les puits.

S’assurer qu’aucune bulle ne soit présente dans les puits dans de lire la plaque.

39.

Présence d’effets bords.

S’assurer que la plaque, et tous les réactifs, sont à température ambiante.

40.

Mauvais stockage.

S’assurer que les réactifs et les échantillons sont stockés dans des conditions appropriées.

41.

Pas de liaison de l’anticorps de capture à la
plaque.

S’assurer que la plaque utilisée est bien faite pour ELISA. Diluer l’anticorps de capture dans du PBS. S’assurer que l’anticorps est préparé correctement, et respecter les temps d’incubation pour
les étapes de revêtement (« coating ») et de saturation.

42.

Variation dans les protocoles suivis.

Ne pas dévier du protocole fourni avec le kit utilisé.

43.

Mauvais calcul de la courbe standard.

Vérifier les calculs, tracer une nouvelle courbe standard et utiliser des contrôles internes.

44.

Contamination des solutions utilisées.

Utiliser des solutions fraîchement préparées.

45.

Rayures dans le fond des puits.

Eviter tout contact avec le fond des puits pendant les étapes de pipetage. Diriger les cônes de pipette vers les parois latérales pour éviter de perturber le fond des puits.


Astuces dépannage ELISA pour un bruit de fond élevé :

46.

Contamination des puits témoins négatifs.

Eviter les contaminations entre puits en utilisant un film approprié pour sceller la plaque. Utiliser la pipette multicanaux sans toucher les réactifs dans la plaque.

47.

Présence de l’analyte recherché dans le témoin négatif ou interférence de la matrice.

Vérifier que la matrice des échantillons ne contient pas de composants cross-réactifs (ex : interleukines recombinantes dans le milieu de culture).

48.

Lavages insuffisants.

Augmenter le nombre de lavages. Augmenter le temps d’incubation dans le tampon de lavage avant l’addition de la solution de substrat.

49.

Présence de cross-réactions.

L’anticorps de détection cross-réagit avec l’anticorps de revêtement (« coating »). Mettre en place les contrôles appropriés.

50.

Liaison non-spécifique des anticorps.

S’assurer qu’une étape de saturation est incluse, et utiliser un tampon de saturation approprié. Nous recommandons d’utiliser une solution contenant 5-10% de sérum provenant de la même espèce que l’anticorps secondaire utilisé, ou du SVF. S’assurer que les puits sont préparés de manière à réduire les interactions non-spécifiques. Utiliser des anticorps purifiés par affinité, de préférence pré-absorbés.

51.

Concentration trop élevée d’anticorps secondaire conjugué.

Concentration trop élevée d’anticorps secondaire conjugué.

52.

Température d’incubation incorrecte.

Concentration trop élevée d’anticorps secondaire conjugué.

53.

Lavage non-adéquat.

S’assurer que les puits sont remplis avec le tampon de lavage et sont ensuite vidés entièrement. Utiliser un laveur de plaque automatique si possible. Ajouter 30 secondes d’étape de trempage entre les lavages.

54.

Présence d’enzymes contaminantes dans
l’échantillon.

Tester l’échantillon avec le substrat seul pour vérifier la présence d’enzymes contaminantes.

55.

Lavage insuffisant des puits.

Laver les puits selon les recommandations du protocole.

56.

Tampon de lavage contaminé.

Préparer des tampons frais.

57.

Excès de réactif de détection.

S’assurer que le réactif de détection est dilué correctement, ou diminuer la concentration recommandée si besoin.

58.

Tampon de saturation ineffectif.

Essayer différentes préparations de tampon de saturation et/ou ajouter du réactif de saturation au tampon de lavage.

59.

Concentrations salines des tampons de
lavage et d’incubation.

Augmenter les concentrations salines permet de réduire les interactions faibles et/ou non-spécifiques.

60.

Attente trop longue avant de lire la plaque
après l’addition de la solution stop.

Lire la plaque immédiatement après l’addition de la solution stop.

61.

Concentration trop élevée d’anticorps.

Essayer différentes dilutions pour obtenir des résultats optimaux.

62.

Incubation du substrat à la lumière.

L’incubation du substrat doit se faire à l’obscurité, ou bien tel que recommandé par le fournisseur.

63.

Formation d’un précipité dans le puits après
l’ajout du substrat.

Augmenter le facteur de dilution de l’échantillon ou diminuer la concentration du substrat.

64.

Plaque sale.

Nettoyer le dessous de la plaque.


Astuces dépannage ELISA pour une absence de signal :

65.

Utilisation du mauvais anticorps de détection
ou oubli de l’anticorps de détection.

Ajouter l’anticorps de détection approprié.

66.

Oubli du conjugué enzymatique (ex : avidine- HRP).

Ajouter le conjugué enzymatique suivant le protocole utilisé.

67.

Oubli de la solution de substrat.

Ajouter la solution de substrat.

68.

Présence d’azide dans le tampon de lavage.

Eviter d’inclure de l’azide dans le tampon de lavage.

69.

Temps d’incubation trop court.

Incuber les échantillons sur la nuit à 4°C ou suivant les recommandations du fournisseur.

70.

Analyte recherché dans l’échantillon en- dessous du seuil de détection.

Réduire le facteur de dilution de l’échantillon ou le concentrer.

71.

Type d’échantillon incompatible.

La détection de l’analyte peut être réduite ou absente dans certains types d’échantillons non-testés. Inclure un échantillon déjà validé par le même essai comme contrôle positif.

72.

Reconnaissance de l’épitope empêchée par l’absorption de la plaque.

Pour améliorer la détection d’un peptide par ELISA direct ou indirect, conjugué le peptide à une large protéine de support avant d’en recouvrir (« coating ») la plaque.

73.

Incompatibilité du tampon du test.

S’assurer que le tampon du test est compatible avec la cible d’intérêt (ex : activité enzymatique conservée, interactions protéiques conservées).

74.

Quantité insuffisante de réactif de détection.

Augmenter la concentration ou la quantité du réactif de détection suivant les recommandations du fournisseur.

75.

Préparation incorrecte de l’échantillon.

S’assurer que l’échantillon a été bien préparé/dilué. Les échantillons peuvent parfois être incompatibles avec le format de la plaque de test.

76.

Quantité insuffisante d’anticorps.

Essayer différentes concentrations/dilutions des anticorps utilisés.

77.

Température d’incubation trop faible.

S’assurer que les étapes d’incubation sont opérées à température correcte. Tous les réactifs, incluant la plaque de test, doivent être à température ambiante, ou selon les recommandations du fournisseur, avant utilisation.

78.

Longueur d’onde de détection du signal
incorrecte.

Vérifier la longueur d’onde à utiliser et relire la plaque.

79.

Lavage de la plaque trop vigoureux.

S’assurer d’une pression correcte si un laveur de plaque automatique est utilisé. Pipeter le tampon de lavage doucement si le lavage est fait manuellement.

80.

Assèchement des puits.

Ne pas laisser les puits sécher complètement une fois le test
commencé. Sceller la plaque avec un film durant les
incubations.

81.

Apparition lente de la couleur de la réaction
enzymatique.

Préparer la solution de substrat juste avant utilisation. S’assurer que la solution mère n’a pas expiré ou n’est pas contaminée.

82.

Couleur non-homogène.

S’assurer que les puits sont correctement lavés ; utiliser un laveur de plaque si possible.

83.

Réactifs pas à température ambiante.

Tous les réactifs doivent être à température ambiante dès le début du test. La température ambiante est atteinte après 15- 20 minutes sur la paillasse.

84.

Expiration des réactifs.

Aucun des réactifs utilisés ne doit être périmé.

85.

Sensibilité de détection du test insuffisante.

Opter pour un test plus sensible (ex : passer d’un ELISA direct à un ELISA « en sandwich »). Augmenter les temps d’incubation ou la température d’incubation. Changer la méthode de détection.

86.

Utilisation d’un tampon contenant du SVF pour reconstituer les anticorps.

Ré-évaluer les réactifs utilisés.


Astuces dépannage ELISA pour une courbe standard suboptimale :

87.

Mauvaise reconstitution ou mauvais
stockage du standard.

Reconstituer le standard suivant les recommandations du fournisseur et suivre les instructions de stockage indiquées.

88.

Concentrations incorrectes des réactifs
ajoutés aux puits.

Vérifier les erreurs de pipetage et le volume des réactifs utilisés.

89.

Température d’incubation incorrecte.

Suivre les recommandations du fournisseur pour le stockage, l’incubation et l’agitation du standard.

90.

Aspiration incomplète des puits lors des
lavages.

Aspirer complètement le liquide des puits entre les étapes; utiliser un laveur de plaque automatique si possible.

91.

Empilement des plaques lors de
l’incubation.

Ne pas empiler les plaques.

92.

Mauvaises dilutions en série.

Vérifier les étapes de dilution suivant les recommandations du protocole.

93.

Réactifs mal homogénéisés.

S’assurer de bien mélanger les réactifs.

94.

Adsorption suboptimale ou variable des
réactifs à la plaque.

Vérifier le choix du tampon de revêtement (« coating »), habituellement du PBS à pH 7,4 ou un tampon carbonate bicarbonate à pH 9,6. Essayer d’étendre cette étape d’incubation. Ou essayer d’autres types de plaque.

95.

Dégradation du standard.

S’assurer que le standard a été stocké correctement.

96.

Mauvaise régression de la courbe standard.

Essayer différents types de régression mathématique.

97.

Erreur de pipetage.

Vérifier les pipettes et les calibrer si besoin.

98.

Pas de liaison de l’anticorps de capture à la
plaque.

S’assurer d’utiliser une plaque ELISA (et non une plaque de culture).

99.

Quantité insuffisante d’anticorps de
détection.

Vérifier la dilution et titrer si nécessaire.

100.

Mauvais calcul de la dilution de la courbe
standard.

Vérifier les calculs et tracer une nouvelle courbe.

101.

Mélange ou substitution de réactifs entre
plusieurs kits.

Eviter ceci car cela peut affecter la qualité de votre test.